Получение селенсодержащих экстрактов из растительного сырья

На сегодняшний день особо остро стоит проблема недостатка важных нутриентов в организме человека [1]. Дефицитмикро- и макроэлементов, витаминов, балластных веществ и пищевых волокон может приводить к острымхроническим заболеваниям, зачастую приводящим к летальному исходу [2]. Одним из таких эссенсиальных элементов является селен, признанный на территории России дефицитным [3]. Для удовлетворения суточной потребности организма в селене необходимо регулярное употребление биологически активных добавок (БАДов), содержащих этот элемент, или продуктов питания профилактической

направленности. Для производства таких продуктов обычно используют растительные экстракты, так как путём экстракции возможно извлечение до 90% содержащихся в растительном материале сухих веществ [4].

Как показывают проведённые ранее исследования, среди прочих сельскохозяйственных культур высоким содержанием экстрагируемых веществ обладают растения семейства амарантовых (содержание белка в листьях составляет 15%, причём этот белок содержит вдвое больше серосодержащих аминокислот, отличающихся хорошей растворимостью и экстрагируемостью [5], а так же растения семейства крестоцветных, содержащие алкалоиды группы глюкобрассицина, которые при разрушении растительной клетки

распадаются, образуя ряд индольных соединений, обладающих высокой экстрагируемостью [6].

В проведённых ранее исследованиях [7, 8] было показано, что амарант овощной и крестоцветные растения, представленные китайской капустой Пак-чой, способны накапливать селен в больших количествах, а в работах Н.А. Голубиной было установлено, что растения сельскохозяйственного назначения в процессе своих метаболических процессов трансформируют минеральные формы селена в селенсодержащие аминокислоты – селенметионин и селенцистеин.

Известны различные способы получения экстрактов из растительного сырья, содержащего различные формы селена, такие как физические, химические и комбинированные [9].

По данным литературных источников установлено, что высокий выход селена можно получить после воздействия на различные виды растительного материалаультразвуком или СВЧ-волнами [10]. Однако при этом разрушаются органические формы селена, что недопустимо, т. к. селен в составе органических соединений теряет свои токсичные свойства и становится безопасным для организма [11]. Помимо этого существуют способы экстракции с использованием ферментных препаратов, способные протекать при более низких температурах, сохраняя структуру аминокислот.

Для извлечения этих соединений из растительных клеток необходимо воздействовать на сырьё ферментами протеолитического действия, направленных на гидролиз белков и пептидов [12]. Так же известно, что целлюлоза, входящая в составклеточных структур может блокировать доступ растворителя к селенсодержащим соединениям. Таким образом внесение в растворитель ферментного препарата целлюлолитического действия позволит интенсифицировать процесс экстракции и увеличить выход экстрактивных веществ. Помимо этого, повышение температуры так же может ускорить процесс экстракции [13], однако, как показали проведённые ранее исследования, при температуре выше 60–65 °С происходит деструкция селенорганических соединений [14]. Поэтому температура экстракции не должна превышать упомянутого значения.

Целью данной работы является определение режима водной экстракции селена из амаранта сорта Харьковский и капусты Пак-чой, обогащённых селеном, с применением ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитического действия.

Материалы и методы

Выбор оптимальных значений параметров экстракции проходил на основании оценки их влияния на выход селенсодеращих органических соединений из китайской капусты Пак-чой и амаранта сорта Харьковский.

В качестве растворителя применялась вода дистиллированная по ГОСТ Р 58144-2018 «Вода дистиллированная. Технические условия». К сожалению, основной извлекаемый селеноорганический компонент из растительного – селенметионин относится к неполярным гидрофобным аминокислотам и при получении его водных экстрактов необходимо применять ферментные препараты [16]. Применение органических растворителей, таких как масла или спирты, так как селенметионин обладает высокой способностью к окислению [15]. Соотношение массы растительного материала к объёму растворителя составляло 1:12.

В качестве ферментного препарата протеолитического действия применялся препарат Дистицим-протацид-экстра изготовленный "ErbsloehGeisenheim AG" (основной фермент – кислая протеаза, температурный оптимум – от 50 до 58 °С, диапазон рН – от 2,0 до 6,0, активность – 350 ед./см3), а в качестве ферментного препарата целлюлолитического действия применялся препарат Вискостар 150Л, изготовленный "ENMEX, S.A. de C.V."(основные ферменты – целлюлаза (активность 25 ед. КМЦ/см3), ксиланаза (активность 15 ед. КС/см3), β-глю-каназа (активность 10 ед. β-ГкС/см3) температурный оптимум30–60 °С, диапазон рН 3,0–7,0,). Данные ферментные препараты обладают одинаковым температурным оптимумом действия и одинаковым оптимумом рН, высокой активностью и низкой стоимостью. Процесс экстракции осуществлялся на водяной бане LB 200 компании «LOIP».

Определение рациональных условий процесса экстракции селенорганических веществ амаранта сорта Харьковский капусты Пак-чой осуществлялось методом полного факторного эксперимента. И в качестве исследуемых переменных параметров были выбраны:

• Х 1 – температура экстракции, °С;

• Х 2 – время экстракции, ч.

• Х 3 – доза ферментного препарата препарат Вискостар 150Л 10^-3 см³ на 1 г сырья;

• Х 4 – доза ферментного препарата Дистицим-протацид-экстра, 10^-3 см³ на 1 г сырья;

По окончании экстракции осуществлялось построение графиков зависимостей содержания сухих веществ в экстрактах с последующим определением оптимального времени экстракции амаранта и капусты Пак-чой.

Результаты и обсуждение

Кодированные единицы и предельные уровни численных значений параметров оптимизации представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Кодированные единицы и предельные уровни численных значений параметров оптимизации процесса экстракции селенорганических соединений из китайской капусты Пак-чой и амаранта сорта Харьковский

Table 1.

Coded units and limiting levels of numerical values of optimization parameters for the extraction process of selenium compounds from Chinese cabbage Pak-choi and amaranth varieties Kharkov

Кодированные единицы Coded Units	Параметры оптимизации и их предельные численные значения Optimization parameters and their limiting numerical values
	Температура экстракции, °С Extraction temperature, ° С	Доза ферментного препарата Дистицим-протацид-экстра, 10-3 см3 на 1 г сырья The dose of the enzyme preparation Dystizim-protacid-extra, 10-3сm3 per 1 g of raw material	Доза ферментного препарата препарат Вискостар 150Л 103 см3 на 1 г сырья The dose of the enzyme preparation Viscostar 150L 10-3сm3 per 1 g of raw material	Время экстракции, ч Extraction time, h
–1	45	0	0	0,5
+1	55	1	1	4
Δ	10	1	1	3,5
0	50	0,5	0,5	2,25

Для исследования влияния выбранных параметров на степень экстракции селенорга-нических соединений из китайской капусты Пак-чой и амаранта в соответствии с методикой полного факторного эксперимента составлен план эксперимента в виде матрицы, определяющий все возможные сочетания варьируемых параметров. Матрица представлена в таблице 2.

В соответствии с планом было проведено 16 опытов, получено 16 образцов водного растительного экстракта, в каждом из которых был измерен показатель содержания экстрактивных веществ %(У). Определение содержания сухих веществ в экстрактах осуществлялось с помощью электронного рефрактометра PTR 46. Определение содержания селена осуществлялосьв экстрактах полученных при максимальном времени экстракции и максимальной дозировкой ферментных препаратов по ГОСТ Р 53182-2008 «Продукты пищевые. Определение следовых элементов. Определение общего мышьяка и селена методом атомноабсорбционной спектрометрии с генерацией гидридов с предварительной минерализацией пробы под давлением».Каждый опыт был повторен трижды для большей достоверности результатов.

Таблица 2.

Матрица эксперимента по экстракции селенорганических соединений

Table 2.

Matrix of the experiment on extraction oforgano-seleniumcompounds

№	Х 1	Х 2	Х 3	Х 4	У (Пак-чой)	У (амарант)
1	45	0,5	0	0	4,36 ± 0,14	2,40 ± 0,05
2	45	0,5	0	1	4,33 ± 0,04	2,53 ± 0,10
3	45	0,5	1	0	4,30 ± 0,15	2,50 ± 0,11
4	45	0,5	1	1	4,67 ± 0,07	2,63 ± 0,12
5	45	4,0	0	0	4,53 ± 0,09	2,70 ± 0,24
6	45	4,0	0	1	5 ± 0,05	2,90 ± 0,09
7	45	4,0	1	0	4,87 ± 0,13	2,87 ± 0,15
8	45	4,0	1	1	5,17 ± 0,15	3,00 ± 0,03
9	55	0,5	0	0	4,43 ± 0,09	2,30 ± 0,07
10	55	0,5	0	1	4,77 ± 0,18	2,40 ± 0,20
11	55	0,5	1	0	4,47 ± 0,08	2,40 ± 0,16
12	55	0,5	1	1	5 ± 0,03	2,77 ± 0,16
13	55	4,0	0	0	5,3 ± 0,14	2,60 ± 0,08
14	55	4,0	0	1	6,3 ± 0,18	2,8 ± 0,18
15	55	4,0	1	0	5,8 ± 0,13	2,63 ± 0,21
16	55	4,0	1	1	7,4 ± 0,21	2,93 ± 0,17

Как видно из таблицы 2, увеличение температуры, и времени экстракции приводит к увеличению выхода экстрактивных веществ. Ферментный препарат Дистицим-протацид-экстра увеличивает выход экстракта на 0,7–7,8% больше, чем препарат Вискостар. Комбинированное действие указанных ферментных препаратов повышает выход экстрактивных веществ на 3,2–14,9% чем одиночный ферментный препарат Дистицим-протацид-экстра и 7,9–21,6% чем одиночный ферментный препарат Вискостар. Наибольший выход экстрактивных веществ наблюдалось при 55 °С и дальнейшие исследования осуществлялись при этой температуре. Содержание селена в экстракте, полученном при температуре 45 °С составило 257,3 мкг×дм-3, а при температуре 55 °С – 284,9 мкг×дм-3

Исходя из таблицы 2, также можно сделать вывод, что увеличение времени экстракции амаранта приводит к увеличению концентрации сухих веществ. Ферментный препарат Дистицим-протацид-экстра увеличивает выход экстракта на 1,0–6,1% больше, чем препарат Вискостар. Комбинированное действие указанных ферментных препаратов повышает концентрацию сухих веществ на 3,8–4,4% чем отдельный ферментный препарат Дистицим-протацид-экстра и 4,9–10,2% чем отдельный ферментный препарат Вискостар. Содержание селена в экстракте, полученном при температуре 45 °С составило 325,8 мкг×дм-3, а при температуре 55 °С – 347,0 мкг×дм-3. Для определения зависимости значений качественных показателей от переменных параметров выбран был выбран вид уравнения регрессии четвёртой степени с учётом межфакторного взаимодействия:

y = b 0 + b_i х 1 + b 2 x 2 + b ₃ x 3 + b 4 x ₄ + b_i2 x 1 x 2 +

+ b i,3 x i x з + b i,4 x i x 4 + b 2,3 x 2 x з + b 2,4 x 2 x 4 + ^{+ b} 3,4 x 3 x 4 ^{+ b} i,2,3 x i x 2 x 3 ^{+ b} i,2,4 x i x 2 x 4 ^{+ +} b 2,3,4 x 2 x 3 x 4 ⁺ b 1,3,4 x i x 3 x 4 ⁺ b i,2,3,4 x i x 2 x 3 x 4

где b 0 , b 1 , b 2 , b 3 , b 4 , – коэффициенты уравнения регрессии, b 1,2 , b 1,3 , b 1,4 , b 2,3 , b 2,4 , b 3,4 , b 1,2,3 , b 1,2,4 , b 2,3,4 , b 1,3,4 , b 1,2,3,4 – промежуточные коэффициенты регрессии.

Определение коэффициентов регрессии производили с помощью математической обработки данных таблицы 2 по методу Бокса.

В результате было получено уравнение регрессии, на основании которого сделаны выводы о степени влияния выбранных параметров на степень экстракции, произведены расчеты значений исследуемых показателей и построены диаграммы зависимости показателей от входных параметров. При получении экстрактов из китайской капусты Пак-чой уравнение регрессии имеет следующий вид:

y = 5,05 + 0,196 x _i + 0,225 x ₂ + 0,495 x ₃ + 0,383 x ₄ +

+ 0,195 x ₂ x ₃ + 0,27 x ₃ x ₄ + 0,i54 x ₂ x ₃ x ₄ (2)

Исходя из полученного уравнения регрессии, наибольшее влияние на выход экстракта из китайской капусты Пак-чой оказывает время экстракции. Максимальное содержание сухих веществ в полученных экстрактах составило 7,4 ± 0,21 г./мл. Содержание селена при максимальной дозировке ферментных препаратов, времени экстракции 24 часа и температуре 45 °С составило 257,3 мкг×дм-3, а при температуре 55 °С – 284,9 мкг×дм-3.

Уравнение регрессии процесса экстракции амаранта с использованием ферментных препаратов протеолитического и целюлолити-ческого действия имеет следующий вид:

y = 2,65 + 0,089 x _i + 0,077 x ₂ + 0, i56 x ₃ (3)

Исходя из полученного уравнения регрессии, наибольшее влияние на выход экстракта из амаранта сорта Харьковский время экстракции, а температура экстракции не оказывает значимого влияния. Максимальное содержание сухих веществ в полученныхэкстрак-тах составило 3,00 ± 0,03 г./мл. Содержание селена при максимальной дозировке ферментных препаратов, времени экстракции 24 часа и температуре 45 °С составило 325,8 мкг×дм-3, а при температуре 55 °С – 347,0 мкг×дм-3.

Для определения оптимального времени экстракции селенорганических соединений была установлена функциональная зависимость содержания экстрактивных веществ в экстракте от времени экстракции. Результаты определений представлены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Динамика накопления сухих веществ в экстрактах из китайской капусты Пак-чой, в зависимости от времени экстракции

Figure1. Dynamics of accumulation of dry substances in extracts from Chinese cabbage Pak-choi, depending on the extraction time

τ, ч

Рисунок 2. Динамика накопления сухих веществ в экстрактах из амаранта сорта Харьковский, в зависимости от времени экстракции

Figure2.Dynamics of accumulation of dry substances in extracts from amaranthv arieties Kharkiv, depending on the extraction time

Из рисунка 1 следует, что при увеличении времени экстракции и дозировки ферментных препаратов происходит увеличение содержания сухих веществ в экстрактах, что так же было доказано в предыдущем опыте.

Из рисунка 2 следует, что при увеличении времени экстракции и дозировки ферментных препаратов происходит увеличение содержания сухих веществ в экстрактах, что так же было доказано в предыдущем опыте. Для определения оптимального времени экстракции с помощью программы CurveExpert были установлены функциональные зависимости содержания сухих веществ в экстрактах от времени экстракции. В таблице3 приведены полученные уравнения.

Таблица 3.

Функциональные зависимости содержания сухих веществ в экстрактах от времени экстракции

Table 3.

Functional dependences of solids content in extracts from the time of extraction

	Продукт Product	Функциональные зависимости содержания сухих веществ в экстрактах от времени экстракции, f(x) Functional dependencies of solids content in extracts from extraction time, f(x)	Коэффициент детерминации, R 2 Coefficient of determination, R 2	dx Производные функций, dt dx Derivatives of functions, dt	Точка экстремума функций The extrema point of functions
Контроль (без внесения ферментных препаратов) Control (without adding of enzyme preparations)	Пак-чой Pak-choi	x	0,991	1135,2 + 357,1 x2	1,78
		0,008 + 0,21 x - 0,0028 x2		(3,17 + 75 x - x 2)2
	амаранта сорта Харьковский amaranth varieties Kharkiv	x	0,987	401,2 - 1,81 - 10 " 12 х + 185,2 x2	2,99
		0,0117 + 0,413 x - 0,0054 x2		(2,17 + 76,48 x - x 2)2
Внесение ферментного препарата Дистицим-протацид-экстра (дозировка 10-3 см3 на 1 г сырья) Addidg enzyme preparation Dystizim-protacid-extra (dosage 10-3сm3 per 1 g of raw material)	Пак-чой Pak-choi	х	0,987	361,4 + 161,3 x2	1,5036
		0,014 + 0,201 х - 0,0062 х2		(2,25 + 32,41 x - x 2)2
	амаранта сорта Харьковский amaranth varieties Kharkiv	х	0,988	4285 - 1,45 -M - 11 х + 476,2 x2	1,24
		0,0189 + 0,381 х - 0,0021 х2		(9 + 181.4 x - x 2)2
Внесение ферментного препарата Вискостар, (дозировка 10-3 см3 на 1 г сырья) Introducing a Addidg enzyme preparation (dosage of 10-3сm3 per 1 g of raw material)	Пак-чой Pak-choi	х	0,994	1453,4 + 588,2 x2	1,571
		0,0042 + 0,191 х - 0,0017 х2		(2,47 + 112,3 x - x 2)2
	амаранта сорта Харьковский amaranth varieties Kharkiv	х	0,992	380,5 + 344,8 x2	1,47
		0,0032 + 0,410 х - 0,0029 х2		(1,103 + 141,4 x - x 2)2
Внесение ферментных препаратов Дистицим-протацид-экстра и Вискостар, (дозировка 10-3 см3 на 1 г сырья) Addidg ferment preparations Dystizim-protacid-extra and Viscostar, (dosing 10-3сm3 per 1 g of raw materials)	Пак-чой Pak-choi	х	0,985	248,7 + 178,5 x2	1,18
		0,0078 + 0,194 х - 0,0056 х2		(1,39 + 34,64 x - x 2)2
	амаранта сорта Харьковский amaranth varieties Kharkiv	х	0,994	48,6 - 5,82 - 10 - 11 х + 833.3 x2	1,05
		7,6 - 10 - 5 + 0,362 х - 0,0012 х2		(0.058 + 301.6 x - x 2)2

UOZ '£ «Д ‘08 'ДБ tba

На основании полученных данных можно заключить, что оптимальным временем водной экстракции китайской капусты Пак-чой при температуре 55 °С является 1,78 часа. Внесение ферментного препарата Дистицим-протацид-экстра дозировкой 10-3 см3 на 1 г сырья позволяет сократить время экстракции на 15,52%. Внесение ферментного препарата Вискостар 150Л дозировкой 10-3 см3 на 1 г позволяет сократить время экстракции на 11,74%. При внесении ферментных препаратов как Дистицим-протацид-экстра, так и Вискостар 150Л дозировкой 10-3 см3 на 1 г позволит сократить время экстракции на 33,7% и составляет всего 1,18 часа.

Заключение

На основании полученных данных можно заключить, что оптимальным временем водной экстракции амаранта при температуре 55 °С является 2,99 часа. Внесение ферментного