Получение специфических компонентов для изготовления эритроцитарного диагностикума при клостридиозах животных

Клостридиозы сельскохозяйственных животных имеют широкое распространение в крупных животноводческих комплексах РФ. Заболевание наносит значительный экономический ущерб предприятиям из-за высокой     смертности     заболевших животных, затрат на проведение лечебнопрофилактических    мероприятий    и снижения продуктивности животных.

Из клостридиозов наиболее часто на практике     встречается     анаэробная энтеротоксемия молодняка, возникающая в результате бурного размножения в кишечнике анаэробных бактерий Cl. perfringens серотипов А, В, С, D, Е, F [3, 4, 7, 8, 10] и всасывания образовавшихся при этом токсинов. Вследствие чего у животных развивается катаральногеморрагический           энтероколит, интоксикация,    поражение    нервной системы, приводящие часто к летальному исходу [4, 10, 11, 12].

В настоящее время диагностику клостридиозов     сельскохозяйственных животных осуществляют на основании результатов клинико-эпизоотологических, патологоанатомических и лабораторных исследований [1,  6,  8]. Разработана иммуноферментная тест-система для серологической             диагностики клостридиозов [5]. Однако этот метод являются трудоемким и требует наличия дорогостоящего оборудования.

Для     диагностики     многих инфекционных заболеваний применяется серологический метод – реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Сущность метода заключается в том, что реакция наступает в том случае, когда к эритроцитам, сенсибилизированными антигеном, т.е. несущим на себе адсорбированный антиген, добавляют иммунную сыворотку, соответствующую антигену. Эта реакция часто превосходит по чувствительности и специфичности другие серологические методы, ее применяют при инфекциях, вызванных бактериями и риккетсиями. Решающим условием для постановки реакции является выбор подходящего антигена. Недопустимо применение нерастворимых антигенов, в частности интактных тканевых клеток или целых бактерий. В реакции могут быть использованы только растворимые тканевые и клеточные экстракты, не вызывающие спонтанной агглютинации сенсибилизированных эритроцитов или гемолиза.

Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов для диагностики сальмонеллеза, микоплазмоза, эшерихиоза. Этот метод не требует дорогостоящего оборудования, прост в постановке. Реакцию можно поставить даже в условиях животноводческих комплексов, что немаловажно, когда необходимо быстро поставить диагноз.

В доступной научно-технической литературе мы не обнаружили информация о способе приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к Cl. perfringens .

Целью настоящих исследований является получение специфических компонентов для изготовления эритроцитарного диагностикума для постановки РНГА при клостридиозах животных. Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

– получить антигены и анатоксины Cl. perfringens для сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана,

– получить контрольные отрицательную и положительную сыворотки крови к антигенам бактерий Cl. perfringens .

Материал и методы исследований. Работу проводили в условиях лаборатории бактериальных патологий животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

В работе использовали следующие материалы и оборудование:

– производственные штаммы Cl. perfringens № 28 (тип А), LD-1 (тип В), № 392 (тип С), № 213 (тип D) , № 342 (тип E),

– питательные среды: мясо-печеночно-казеиновая, МПА, МПА с 15 %-ным содержанием дефибринированной крови барана, МПБ, – фосфатно-солевой буферный раствор, 0,85 % изотонический раствор NaCl, формалин 37 %, вазелиновое масло, сульфат аммония, стерилизатор паровой вертикальный автоматический СПВА-75-1-НН, микроскоп медицинский «Микмед-5», центрифуга ОС-6М, спектрофотометр ПЭ-5400УФ, ультразвуковой дезинтегратор «Bandelin GM3100», термостат электрический суховоздушный ТС-1/80 СПУ, бокс ламинарный БАБ-11- «Ламинар-С»-1,2.

Результат исследований.

Антигены и анатоксины, необходимые для сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, изготовили из производственных штаммов Cl. perfringens № 28 (тип А), LD-1 (тип В), № 392 (тип С), № 213 (тип D) , № 342 (тип E).

Анатоксины Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е получали по отдельности путем посева производственных штаммов в жидкую мясо-печеночно-казеиновую среду под вазелиновым маслом. Для этого в питательную среду, находящуюся в стеклянной колбе, добавляли суточную бульонную культуру Cl. perfringens из расчета 10 % к объему. Посевы инкубировали в течение 10 ч при температуре от 37 оС до 38 оС. При этом концентрация токсинов в культуре достигала до 4-5 Dlm/см3. Для превращения токсинов в анатоксин в культуру вносили формалин до 0,5 %-ной конечной концентрации и выдерживали при температуре от 37 оС до 38 оС в течение 10 суток. Затем, после удаления вазелинового масла, культуру центрифугировли при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осадок, представлявший собой бактериальные клетки Cl. perfringens, удаляли, а анатоксин (надосадочная жидкость) использовали для сенсибилизации эритроцитов. Очистку и концентрирование анатоксинов проводили методом осаждения их сульфатом аммония путем добавления его до 50 % к общему объему (в конечной концентрации). Далее смесь центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 минут, затем осадок ресуспенсировали дистиллированной водой в соотношении 1:10. Полученный анатоксин диализировали против дистиллированной воды в течение 24 ч.

Для получения соматических антигенов штаммы Cl. perfringens серотипов А, В, С, D, Е высевали на мясопептонный агар с добавлением 2 % глюкозы и 15 % дефибринированной крови барана. Посевы инкубировали в анаэростате при температуре 37 оС в течение 24 ч. Выросшую культуру смывали 0,85 % изотоническим раствором NaCl. Бактериальную взвесь трижды отмывали стерильным 0,85 % изотоническим раствором для освобождения от компонентов питательной среды путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 минут. Осадок микробных клеток разводили стерильным 0,85 % изотоническим раствором до получения взвеси с концентрацией 20 млрд микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности Л.А. Тарасевича. Микробные клетки разрушали ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 мин при температуре 4 оС. Затем суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осадок удаляли, надосадочную жидкость использовали в качестве антигена для сенсибилизации эритроцитов барана.

В антигенах и анатоксинах определяли концентрацию белка с помощью спектрофотометра по методу Лоури. Концентрацию белка доводили до 0,4-0,5 мг/мл фосфатно-солевым буферным раствором (рН 6,4).

Полученные антигены и анатоксины использовли для сенсибилизации эритроцитов барана, необходимых для создания эритроцитарной тест-системы.

Контрольные положительные и отрицательные сыворотки к антигенам бактерий Cl. perfringens типов А, В, С, D, E получали на 10 кроликах живой массой 33,5 кг. Для гипериммунизации композиционную смесь антигенов Cl. perfringens вводили в краевую вену уха трижды с интервалом 4 дня. На первом этапе объем вводимой смеси составлял 0,5 мл, на втором - 1 мл и на третьем - 2 мл. Через семь дней после поледнего введения антигена отбирали кровь для проверки титров и специфичности присутствующих антител. Отрицательную контрольную сыворотку получали от интактных кроликов в возрасте от полугода до года, после выдерживания их в карантине в течение 30 дней.

На основе полученных антигенов, контрольных положительной и отрицательной сывороток разработали эритроцитарную тест-систему для определения специфических антител к бактериям Cl. perfringens.

Для определения активности и специфичности компонентов тест-системы проводили постановку РНГА с контрольными сыворотками (положительной и отрицательной к Cl. perfringens ) и гетерологическими (гипериммунные сыворотки к Escherichia coli , Moraxella bovis ). Реакцию ставили в круглодонных планшетах для иммунологических реакций с объемом 200 мкл. Результаты реакции выражали крестами.

При постановке реакции контрольные сыворотки разводили с 1:8 до 1:1024. В качестве разбавителя использовали 0,15 М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4. Провели испытание 3-х серий эритроцитарного клостридиозного диагностикума в РНГА, результаты которых приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты испытания компонентов тест-системы на активность и специфичность

Наименование исследуемых сывороток	Серии диагности-кума	Разведение сывороток
		1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024
Сыворотка положительная к Cl. perfringens	1	+++++	++++	+++++	++++	++++	+++	+	-
	2	+++++	++++	++++	++++	+++	++	-	-
	3	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-
Сыворотка отрицательная к Cl. perfringens	1	-	-	-	-	-	-	-	-
	2	-	-	-	-	-	-	-	-
	3	-	-	-	-	-	-	-	-
Сыворотка положительная к Ecshericia coli	1	+	-	-	-	-	-	-	-
	2	+	-	-	-	-	-	-	-
	3	+	-	-	-	-	-	-	-
Сыворотка положительная к Moraxella bovis	1	++	-	-	-	-	-	-	-
	2	++	-	-	-	-	-	-	-
	3	+	-	-	-	-	-	-	-
Фосфатнобуферный физиологический раствор (рН 7,2)	1	-	-	-	-	-	-	-	-
	2	-	-	-	-	-	-	-	-
	3	-	-	-	-	-	-	-	-

Из таблицы видно, что с положительной клостридиозной сывороткой диагностикум реагирует на четыре креста до разведения 1:128, на три креста 1:256, на один крест 1:512. С гетерологичными

сыворотками

сомнительная реакция на два креста наблюдается в разведении 1:8. С отрицательной сывороткой и фосфатносолевым буферным раствором наблюдается отрицательная реакция во всех разведениях.

Заключение. Для создания эритроцитарного диагностикума, предназначенного для диагностики клостридиозов сельскохозяйственных животных, получены специфические антигены и положительная сыворотка к бактериям Cl. perfringens серотипов А, В, С, D, Е, лабораторные испытания которых показали высокую активность и специфичность.