Получение стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный белок I329L вируса африканской чумы свиней

Африканская чума свиней (АЧС; возбудитель — вирус из семейства Asfarviridae , род Asfivirus, African swine fever virus, ASFV) — инфекционная болезнь диких и домашних свиней, характеризующаяся высокой летальностью и контагиозностью, сверхострым, острым, подострым и хроническим течением, передающаяся от больных животных и вирусоносителей контактным и алиментарным путем. В Российской Федерации АЧС регистрируется с 2007 года. На протяжении последних лет страна считается территорией стационарного неблагополучия по этому заболеванию (1).

Геном вируса состоит из линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) размером около 170 и 190 т.п.н. в зависимости от изолята. К вирусу АЧС восприимчивы все представители семейства Suidae . Основной резервуар вируса — мягкие клещи рода Ornithodoros (2). Нуклеотидные последовательности генома референтого штамма Ba71V ASFV содержат 150 открытых ра-

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант ¹ 16-16-00090).

мок считывания (open reading frame, ORF). В инфицированных ASFV клетках выявлено 95 полипептидов с молекулярной массой от 10 до 220 кДа (1). ASFV обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится основным препятствием для создания средств защиты от болезни (3). Один из используемых вирусом способов иммунного уклонения основан на мимикрии Toll-подобных рецепторов (TLR). Эти рецепторы ответственны за опознавание вирусной двухцепочечной РНК (ДНК) и активируют врожденный иммунитет (4). На сегодняшний день у млекопитающих известно 13 Toll-подобных рецепторов. Они активируются различными лигандами, в основном структурными компонентами бактерий и вирусов. Рецепторы также различаются адаптерными пептидами, с которыми связываются их цитозольные фрагменты (5).

Один из белков ASFV, участвующих в модуляции опосредованного Toll-подобным рецептором механизма защиты, — рI329L, антагонист и ингибитор сигнального пути TLR3 (6, 7). Функциональный анализ показывает, что pI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и IFN-b через активацию TLR3 с лигандом — вирусной ДНК, РНК или poly (I:C) (8, 9). Следовательно, белок I329L служит вирусным антагонистом TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина (10). В настоящее время отсутствует какая-либо информация о белке I329L ASFV, циркулирующего на территории России. Нет данных о его генетической стабильности (11, 12), а также инструментов (стабильная клеточная линия) для изучения механизма действия иммуномодулирующего белка рI329L ASFV российского происхождения.

В этой статье нами впервые предоставлены данные о рекомбинантном белке I329L — продуценте клеточной линии млекопитающих (CHO), аутентичном вирусному белку ASFV.

Цель работы — получение стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный белок I329L вируса африканской чумы свиней.

Методика. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности белка I329L взяты из базы данных UniProt (референсный номер E0WM90) . Дизайн плазмиды pBMN-I329L-his моделировали в программе Clone Manager 7.0 («Sci-Ed Software», США). ДНК выделяли из референтного штамма Ставрополь 01/08 ASFV (Государственная коллекция ФГБУ ФИЦВиМ) (20) с помощью набора QIAamp DNA Blood, Mini Kit («Qiagen N.V.», Германия).

Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли с использованием Phusion полимеразы («NEB», США) согласно инструкции производителя. Реакционная смесь включала 10 мкл 5½ Phusion HF буфера, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 2 мкл 10 мкМ F329his, 2 мкл 10 мкМ R329his, 1,5 мкл DMSO, 0,5 мкл Phusion DNA Polymerase, 1 мкл вирусной ДНК и 31 мкл стерильной воды. В работе использовали пару праймеров: F329his (прямой) — 5 ' -TATATAAAGCTTGCCACCATGCTAAGGGTTTTCATA-3 ' , R329his (обратный) — 5 ' -TATATATCTAGATTATCAATGGTGGTGGTGATGGTGC-TTTCTTCTTGAACATGAA-3 ' . R329his содержал His-tag пептидную метку на C ' -конце. Амплификацию целевого гена проводили по протоколу: предварительная денатурация 5 мин при 98 ° С; денатурация 30 с при 98 ° С, отжиг праймеров 30 с при 52 ° С, элонгация 60 с при 72 ° С (25 циклов). Ам-плифицированный продукт ожидаемого размера был идентифицирован в 1,3 % ТБЕ-агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.

ДНК очищали от агарозного геля c помощью набора Gel Extraction Kit («Qiagen N.V.», Германия) согласно инструкции производителя. ПЦР-продукт I329L клонировали по сайтам эндонуклеазного расщепления HindIII 1252

и XbaI («NEB», США) в вектор pBMN («Addgene», США), имеющий гены устойчивости к ампициллину и пуромицину. Лигирование вектора и вставки осуществляли с помощью ДНК-лигазы фага Т₄ («NEB», США) в объеме 5 мкл (0,5 мкл 10½ лигазного буффера, 1 мкл линеаризованного вектора pBMN, 0,5 мкл ПЦР-продукта I329L , 0,5 мкл ДНК лигазы Т₄ и 2,5 мкл стерильной воды) при комнатной температуре в течение 1 ч.

Трансформацию клеток Escherichia coli штамма XL-10 Gold, генотип endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tetR F ' (proAB lacIqZAM15 Tn10(TetR Amy CmR), лигазной смесью проводили стандартным методом теплового шока. ДНК плазмид выделяли с помощью набора Plasmid Mini Kit («Qiagen N.V.», Германия). Выделенные плазмидные ДНК клонов проверяли с помощью аналитической рестрикции с использованием фланкирующих эндонуклеаз HindIII и XbaI. Точность воспроизведения последовательности клонированного фрагмента подтверждали с помощью секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl («Applied Biosystems», США).

Трансфекцию клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка) осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulse Xcell («Bio-Rad», США). Перевиваемую линию клеток CHO культивировали в шейкере-инкубаторе при 37 ° С и 5 % СО 2 в среде BalanCD («Irvine», США) c добавлением 500000 ЕД пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 4 мМ L-глютамина. Жизнеспособность и количество живых клеток оценивали при окрашивании 1 % раствором трипанового синего («Gibco», США). Для этого в пробирку отбирали 20 мкл клеточной суспензии, к которой добавляли 80 мкл 1 % раствора трипанового синего (окрашивание мертвых клеток) и затем тщательно перемешивали. Результаты учитывали на автоматическом счетчике клеток NucleoCounter NC100 («ChemoMetec», Дания).

Белок I329L ASFV выделяли с помощью магнитных частиц Dyna-Beads His-tag («Thermo Scientific», США). Для дегликозилирования белка I329L использовали пептид-N-гликозидазу F (PNGаза F) («NEB», США) и эндогликозидазу H (Endo H) («NEB», США). Детекцию целевого белка осуществляли иммуноблотингом в 12,5 % полиакриламидном геле с последующим переносом в системе Trans-Blot Turbo («Bio-Rad», США) на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Мембрану инкубировали с кроличьими поликлональными антителами к 6½ His-tag (HRP) («Abcam», США). Для визуализации реакции применяли хемилюминесцентные реагенты («Advansta», США). Специфичность рекомбинантного белка I329L подтверждалась взаимодействием с гипериммунными свиными сыворотками от животных, зараженных штаммом Ставрополь 01/08 ASFV (Государственная коллекция ФГБУ ФИЦВиМ), и коммерческими антивидовыми антителами козы против IgG свиньи, меченными пероксидазой хрена (HRP) («Santa Cruz Biotechnology», США).

Результаты. В работе использовали ДНК, экстрагированную из культуры клеток костного мозга свиней, инфицированных штаммом Ставрополь 01/08 ASFV. Полученную матрицу использовали при постановке ПЦР с геноспецифическими праймерами (F329his и R329his) для амплификации фрагмента с сайтами рестрикции и последующим клонированием в вектор pBMN. В результате получили ПЦР-продукт размером 1023 п.н. При лигировании соотношение вектора и вставки составило 1:3.

Аналитическая рестрикция по сайтам фланкирующих эндонуклеаз подтвердила наличие специфической вставки гена I329L (рис. 1, Б) у четырех клонов. Их верифицировали секвенированием на корректность вставки и наличие замен или делеций. После сравнительного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей был отобран клон pBMN-I329L-his, идентичный последовательности референсного гена I329L штамма Georgia/wb/2007 ASFV (FR682468).

А

Б

Рис. 1. Схема плазмиды pBMN-I329L-his, несущей целевой ген I329L вируса африканской чумы свиней (ASFV) (А) , и скрининг клонов плазмиды pBMN-I329L-his с помощью аналитической рестрикции эндонуклеазами HindIII и XbaI («NEB», США) (Б) : 1-4 — клоны ¹¹ 1-4 pBMN-I329L-his, М — маркер молекулярной массы 100 bp Plus («Fermentas», США).

Рис. 2. Жизнеспособность (А) и скорость роста (Б) клеточной линии CHO-I329L-His (1) и исходной клеточной линии CHO (2) в процессе 7-суточного культивирования на среде BalanCD с добавлением 5 мкг/мл селективного антибиотика пуромицина («AppliChem», Германия) .

При создании стабильной клеточной линии CHO-I329L-His использовали культуру клеток СНО, находящуюся в фазе логарифмического роста. Жизнеспособность клеток, трансфицированных плазмидой pBMN-I329L-his, оценивали через 24 и 48 ч в тесте с трипановым синим. Через 24 ч после трансфекции клеток CHO плазмидой pBMN-I329L-his жизне-1254

способность клеток составила 70 %, плотность суспензии живых клеток — 1,0 млн/мл (в контрольной трансфекции без плазмиды эти показатели составили соответственно 92 % и 1,0 млн/мл). Повторный анализ клеток проводили на 48-й ч после трансфекции. При этом доля живых клеток увеличилась до 83 %, количество живых и трансфицированных плазмидой клеток — до 2,2 млн/мл; в контроле показатели возросли соответственно до 94 % и 4,0 млн/мл. Полученные данные подтвердили эффективность трансфекции клеток CHO и возможность их дальнейшей селекции в среде с пуромицином («AppliChem», Германия). Через 48 ч после трансфекции весь пул клеток перенесли в ростовую среду BalanCD с добавлением пу-ромицина в конечной концентрации 5 мкг/мл.

При модельном 7-суточном суспензионном культивировании мы оценили динамику жизнеспособности и концентрацию жизнеспособных трансфицированных клеток в сравнение с родительской клеточной линией CHO (рис. 2). По результатам эксперимента, 80 % порог жизнеспособности был достигнут только на 7-е сут культивирования. На протяжении 7 сут в стабильной клеточной линии CHO-I329L-His присутствовало более 80 % жизнеспособных клеток.

Интеграцию гена I329L ASFV в геном клеточной линии CHO подтвердили в ПЦР, использовав в качестве внутреннего положительного контроля референсные праймеры для b-актина (NM_001244575.1) и цитохрома b (AB033693) клеточной линии CHO. В результате последовательности гена I329L были выявлены в тотальной геномной ДНК, выделенной из стабильной клеточной линии CHO-I329L-His (рис. 3, А).

Рис. 3. Анализ интегрирования гена I329L вируса африканской чумы свиней (ASFV) и продуцента клеточной линии CHO-I329L-His методами ПЦР и иммуноблотинга.

• А:    Выявление гена I329L в геноме клеточной линии CHO-I329L-His при электрофоретическом разделении ПЦР-продуктов: 1 — амплифицированный ген I329L из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; 2 — амплифицированный ген b-актина из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; 3 — амплифицированный ген цитохрома b из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; М — маркер молекулярной массы 100 bp Plus («Fermentas», США).

Б: Иммуноблотинг рекомбинантного белка I329L ASFV после дегликозирования эндогликозидазами EndoH и PNGaseF при использовании His-taq антител: 1 — белок I329L, выделенный на магнитных частицах DynaBeads His-tag («Thermo Scientific», США); 2 — белок I329L, обработанный эндогликозидазой EndoH («NEB»,США); 3 — белок I329L, обработанный эндогликозидазой PNGase F («NEB», США); М — маркер молекулярной массы Page Presteined Ruler («Fermentas», США).

• В:    Иммуноблотинг рекомбинантного белка I329L, связанного с гипериммунной сывороткой против ASFV: 1 — белок I329L, выделенный на магнитных частицах DynaBeads His-tag («Thermo Scientific», США); М — маркер молекулярной массы Page Presteined Ruler («Fermentas», США).

Анализ экспрессии целевого белка I329L ASFV проводили с помощью иммуноблоттинга с использованием специфических антител к His-tag, находящемуся на C-конце молекулы. Для этого клетки (5½10), отобранные от стабильной клеточной линии, подвергали лизису с последующим концентрированием на магнитных частицах DynaBeads His-Tag. Им-муноблотинга подтвердил продукцию белка I329L в стабильной клеточной линии CHO-I329L-His. Однако по результатам анализа можно сделать вывод, что продукт экспрессии белка I329L, размер которого находился в пределах 55-60 кДа (см. рис. 3, Б), не соответствовал расчетной молекулярной массе (35 кДа). Этот факт можно объяснить высокой степенью гликозилирования белка I329L, что снижает электрофоретическую подвижность молекулы. Полученные данные также подтверждаются биоин-форматическим анализом (установлено наличие 9 сайтов N-гликозилирования) (15, 17). Дополнительно можно наблюдать слабую полосу с молекулярной массой 35 кДа (см. рис. 3, Б), наличие которой может объяснять трансляцию белка с одного из трех стартовых кодонов (ATG) в его экс-траклеточной области (17, 18). Следует отметить, что на электрофореграмме также наблюдались следы протеолизного расщепления целевого белка.

В результате обработки рекомбинантного белка I329L эндогликози-дазой Endo Н или PNG-азой F его молекулярная масса уменьшалась до ∼ 37 (Endo Н) и ∼ 35 кДа (PNGазой F), следовательно, исходно экспрессируемый белок I329L был высокогликозилированным (см. рис. 3, Б). Кроме того, молекулярная масса I329L, обработанного PNGазой F, оказалась ниже, чем после расщепления эндогликозидазой Endo H, что указывало на присутствие небольшого количества сложных гликанов.

При анализе связывания I329L c гипериммунной сывороткой от животных, зараженных штаммом Ставрополь 01/08, с помощью имму-ноблотинга наблюдали образование иммунных комплексов I329L c поликлональными антителами к ASFV (см. рис. 3, В).

Таким образом, мы получили стабильную клеточную линию CHO-I329L-His, экспрессирующую рекомбинантный полноразмерный трансмембранный белок I329L вируса африканской чумы свиней ASFV. Клеточная линия CHO-I329L-His обладает схожими фенотипическими и ростовыми свойствами с родительской линией CHO. Рекомбинантный белок I329L ASFV не токсичен для клеток СHO. Встройка гена I329L в геном клеток CHO подтверждена методом ПЦР и с помощью анализа экспрессии целевого белка. Выявлено наличие гликозилированных форм белка I329L ASFV. По результатам анализа связывания I329L с гипериммунной сывороткой против ASFV показана его антигенная специфичность. Клеточная линия CHO-I329L-His представляет собой уникальную модель для изучения взаимодействия ASFV с клеткой и создания дефектных рекомбинантных ASFV в качестве кандидатных вакцин. Стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии. Культура клеток может быть использована для изучения механизмов действия иммуномодулирующих белков и позволит получить новые данные о биологических свойствах ASFV.