Получение стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный белок I329L вируса африканской чумы свиней

Вирус африканской чумы свиней (АЧС, African swine fever virus, ASFV) - крупный ДНК-содержаний вирус, единственный представитель семейства Asfarviridae. Вирус АЧС обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится препятствием для создания средств защиты от болезни. Один из способов иммунного уклонения, используемых вирусом, - мимикрия Toll-подобных рецепторов (TLR) иммуномодулирующими белками. Иммуномодулирующие белки вируса АЧС можно рассматривать как потенциально ценные инструменты для понимания патогенеза заболевания и создания средств борьбы с ним. Так, белок рI329L служит антагонистом и ингибитором сигнального пути TLR3, уменьшающим интерфероновый ответ. Белок рI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и индукцию INF-b через активацию TLR3 с его лигандом - вирусной ДНК, РНК и poly(I:C). Удаление этого белка из ASFV служит рациональным подходом к разработке ослабленной вирусвакцины. Следовательно, I329L представляет собой вирусный антагонист TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина. Целью настоящей работы было получение клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка), стабильно экспрессирующей рекомбинантный белок I329L ASFV. Нами сконструирована плазмида pBMN-I329-his, несущая полноразмерный ген I329L ASFV с полигистидиновой меткой (His-tag) на C-конце. При помощи электропорации и культивирования в среде с антибиотиком пуромицином была получена стабильная клеточная линия CHO-I329L-His, несущая рекомбинантную плазмиду pBMN-I329- his. Встраивание гена I329L в геном клеток выявляли в ПЦР с геноспецифическими праймерами с последующим нуклеотидным секвенированием, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из клеток CHO-I329L-His. С помощью иммуноблотинга подтверждено наличие белка I329L в лизате клеток. Размер рекомбинантного белка составлял 55 кДа при расчетной молекулярной массе 35 кДа. Последовательное дегликозилирование целевого белка эндогликозидазами PNGase и Endo H приводило к увеличению его электрофоретической подвижности и детектированию спейсцифических полос ~37 и ~35 кДа. Этот факт подтверждает высокую степень гликозилирования целевой молекулы, что приводит к меньшей электрофоретической подвижности. Дополнительно показано, что рекомбинантный белок I329L взаимодействовал с гипериммунными сыворотками против штамма Ставрополь 01/08 ASFV, что свидетельствовало об его аутентичности вирусному белку. Полученная стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии и может быть использована для изучения иммуномодулирующих локусов ASFV.