Получение трансгенных мышей, экспрессирующих в клетках коркового вещества волос шерсти белок медузы, флуоресцирующий в зеленой области спектра

Наряду с изучением фундаментальных вопросов трансгенеза пристальное внимание исследователи уделяют созданию трансгенных особей — продуцентов биологически активных веществ, а также трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к заболеваниям или имеющих улучшенные продуктивные качества. Среди основных задач повышения продуктивности овцеводства большое значение имеет повышение качества и увеличение количества шерсти. При оценке шерсти учитывают следующие показатели: прочность, гибкость, растяжимость и упругость волокна. Твердый кератин, содержащийся в корковом веществе волос, обусловливает механические свойства шерсти (1).

В образовании рогового вещества волос — кератина — участвуют белки промежуточных филаментов последнего (intermediate filament, IF) и кератин-связывающие белки (keratin-associated proteins, KAP) (2). Промежуточные филаменты кератина состоят из белков двух типов (I и II), которые совместно экспрессируются в дифференцирующихся клетках коркового вещества нижней части стержня волоса, образуя филаменты диаметром 8-10 нм (3). Гены белков промежуточных филаментов кератина активируются в период формирования стержня волоса (4), в то время как гены, контролирующие синтез KAP-белков, начинают функционировать на более поздних стадиях дифференцировки клеток коркового вещества волос ( 5). Сравнительный анализ промоторной области генов кератина овец позволил выявить консервативность нуклеотидной последовательности промотора гена белка промежуточного филамента (II тип) кератина шерсти этих животных (4).

Известно, что нити паутины на разрыв в 5 раз прочнее стали и способны вытягиваться на 1/3 своей длины. Как показали исследования во многих лабораториях мира, паутина — это сложнейший композиционный материал, в состав которого входят белки двух видов и вода (5-6 %). Молекулы белков переплетены, причем часть белка находится в аморфном состоянии, а часть (от 30 до 45 %) — в виде кристаллов: первые обеспечивают эластичность, а вторые — прочность (6). Клонирование генов, контролирующих синтез белков паутины, и промотора гена IF белка II типа кератина шерсти овец позволяет создавать трансгенных овец с улучшенными механическими свойствами шерсти (7-9).

На предварительном этапе получения трансгенных сельскохозяйственных животных анализируют тканеспецифическую экспрессию чужеродных белков у модельных животных, которыми служат в основном лабораторные мыши. Создание генетических конструкций, включающих последовательности генов маркерных (репортерных) белков, таких как β-галактозидаза Escherichia coli или белок, флуоресцирующий в зеленой области спектра (green fluorescent protein, GFP), медузы Aequorea victoria, позволяет выявить функциональную способность того или иного промотора, обусловливающего экспрессию белков в различных тканях трансгенных животных.

Фотолюминесценция GFP и его мутантных форм легко выявляется в живых и фиксированных формалинальдегидом тканях трансгенных особей с помощью стандартных оптических приборов, имеющих источник длинноволнового ультрафиолетового света и предназначенных для выявления люминесценции флуоресцентных красителей, используемых в гистологии (10-12).

Цель наших исследований заключалась в оценке с помощью модельных животных функциональной активности нуклеотидных последовательностей (730 п.н.) консервативного промотора K2.10 (8), контролирующего у овец ген белка промежуточных филаментов (II тип) кератина шерсти. При этом были поставлены следующие задачи: получить трансгенных мышей, экспрессирующих улучшенный белок A. victoria , флуоресцирующий в зеленой области спектра (EGFP), в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос шерсти; оценить характер наследования трансгена у экспериментальных животных в F 1 и F 2 ; исследовать кожу и волосы трансгенных мышей на наличие флуоресцирующего в зеленой области спектра ре-портерного белка EGFP; провести иммуногистохимический анализ тканеспецифической экспрессии EGFP на гистологических срезах кожи трансгенных животных.

Методика . Объектом исследования служили гибридные серые мыши, в пронуклеусы зигот которых методом микроинъекции вводили генетическую конструкцию KERSH—EGFP, содержащую ген улучшенного белка A. victoria , флуоресцирующего в зеленой области спектра (EGFP) под контролем промотора K2.10 (13). Первых полученных трансгенных особей скрещивали с белыми нелинейными мышами; трансгенных животных F₁ спаривали друг с другом или с нетрансгенными (контроль) особями F 1 .

Анализ ДНК мышей на содержание нуклеотидных последовательностей генноинженерной конструкции KERSH—EGFP осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции (14, 15). Флуоресценцию EGFP в волосяном покрове и клетках волосяных фолликулов оценивали у трансгенных мышей белой окраски с помощью люминесцентного микроскопа OPTON с использованием набора фильтров BP 450-490, FT 510 и LP 520.

Для иммуногистохимического анализа тканеспецифической экспрессии флуоресцирующего в зеленой области спектра белка в волосяных фолликулах взрослых и 28-суточных трансгенных особей применяли биотиновый метод окрашивания парафиновых срезов кожи (непрямой авидин) (16). При этом использовали моноклональные антитела мышей к GFP («Sigma», США), а также следующие реактивы: стандартный набор «Novostain Super ABC Kit» (universal) (NOVOCASTRA Lab., Великобритания), содержащий биотинилированные антитела свиньи к иммуноглобулинам мышей, неиммунную сыворотку и авидин-биотин-пероксидазный комплекс; набор «AEC STAINING KIT» («Sigma», США), включающий хромоген-3-амино-9-этилкарбазол (АЭК).

Фотографирование, анализ препаратов кожи и волос в белой и синей областях спектра люминесцентного микроскопа осуществляли с помощью цифровой камеры Olympus camedia c-4000z (Япония) и компьютерной программы ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Статистическую обработку данных оценки характера наследования трансгена в F₁ и F₂ и сопоставление эмпирической и теоретической частоты наследования трансгенных последовательностей проводили с использованием критерия χ ² .

Результаты. Мы основывались на гипотезе о моногибридном наследовании трансгена при доминантном гетерозиготном (гемизиготном) состоянии последнего у потомков от скрещивания трансгенных и нетрансгенных (контроль) особей. Количество трансгенных особей, полученных нами в F 1 от пяти первичных трансгенных мышей, не соответствовало теоретически ожидаемой частоте наследования трансгена (табл.). Среди потомков F 2 от скрещивания трансгенных и нетрансгенных особей частота наследования трансгена приближалась к прогнозируемой — 50 %.

Количество трансгенных мышей, содержащих генно-инженерную конструкцию KERSH-EGFP, в F 1 и F 2

¹ и пол первичной трансгенной особи	Число потомков F 1		Доля трансгенных особей в F 1 , %	Число потомков F 2		Доля трансгенных особей в F 2 , %
	всего	трансгенных		всего	трансгенных
780 d	41	9	21,95	41	17	41,46
750 d	50	17	34,00	51	26	50,98
161 d	16	2	12,50	–	–	–
129 ?	11	1	9,09	38	18	46,31
^177 9	8	2	25,00	12	6	50,00

Между средней арифметической по числу трансгенных особей в F₁ и F₂ достоверность разности составляла 95 %. При расчете критерия χ ² по F 1 анализировали данные по двум первичным трансгенным самцам (¹ 750 и ¹ 780), от которых было получено достаточное для статистической обработки количество потомков. В F₁ у самцов ¹ 780 и ¹ 750 χ ²факт. составлял соответственно 12,9 (P < 0,001) и 5,12 (P < 0,05). В F 2 отклонения расщепления в опыте от теоретически ожидаемого были недостоверными и носили случайный характер ( χ ²факт. < χ χ ²табл. ). При спаривании гемизиготных трансгенных сибсов F 1 друг с другом с целью получения гомозиготных особей доля трансгенных животных в F₂ у потомков самцов ¹ 780 и ¹ 750 составляла соответственно 86 и 67,5 %.

При выявлении экспрессии EGFP в клетках коркового вещества волосяных фолликулов (кератиноцитах) и стержнях волос трансгенных мышей белой окраски в F 2 в качестве эталона флуоресценции EGFP в зеленой области спектра мы использовали трансформированные бактерии E. coli , экспрессирующие EGFP при культивировании на селективной среде, содержащей индуктор — IPTG.

При анализе флуоресценции волос трансгенных особей и белых мышей (контроль) выявлена незначительная люминесценция волосяных стержней у последних, причем спектр и интенсивность флуоресценции отличались от таковых трансформированных бактерий, имеющих EGFP.

Среди 32 трансгенных мышей белой масти, полученных в F₂ от скрещивания гемизиготных сибсов F₁ между собой или трансгенных особей F₁ с нетрансгенными (контроль), только у семи потомков были обнаружены отдельные ярко люминесци-рующие волосяные волокна. При этом спектр и интенсивность наблюдаемой флуоресценции были аналогичны таковым у трансформированных бактерий E. coli .

Мозаичный характер экспрессии генов чужеродных белков был отмечен у трансгенных мышей, экспрессирующих в клетках волосяных фолликулов Т-антиген вируса SV 40 под контролем промотора гена К2.10 длиной 2800 п.н. (9) или β -галактозидазу под контролем промотора того же гена длиной 400 п.н. (2). Предполагается, что мозаичность экспрессии трансгенов у трансгенных животных обусловлена интеграцией экзогенных последовательностей в участки хромосом, расположенные вблизи соединения эухроматиновой и гетерохроматиновой областей (9).

При оценке с помощью компьютерной программы ImageScope Color интенсивности флуоресценции в зеленой области спектра у одной из трансгенных особей белой окраски, имеющей отдельные интенсивно светящиеся волосяные волокна, и нетрансгенной мыши (контроль) показатели составляли соответственно 93,0 ± 2,5 и 61,0 ± 1,1 усл. ед. (P <  0,001). Интенсивность флуоресценции 77 волосяных волокон в зеленой области спектра у трансгенной особи составляла 154,0 ± 1,5 усл. ед., что значительно превышало таковую в контроле (P <  0,001).

В результате иммуногистохимического окрашивания серии парафиновых срезов кожи четырех взрослых трансгенных мышей белой окраски специфическое связывание моноклональных антител к GFP наблюдалось только у одной особи в клетках формирующегося стержня нового волоса (на участках кожи при замене старых волосяных фолликулов на новые). У этой особи при оценке волос шерсти в синей области спектра люминесцентного микроскопа были обнаружены отдельные ярко флуоресцирующие волосяные волокна. По данным Powell с соавт., гены белков промежуточных филаментов кератина млекопитающих активируются в период фор- мирования и роста волос в функциональных дифференцирующихся клетках коркового вещества волосяного стержня (4).

Поскольку у мышей волосяной покров начинает формироваться на 4-6-е сут после рождения, для выявления экспрессии EGFP в фолликулах растущих волос мы анализировали образцы кожи трансгенных мышей на 2-8-е сут после рождения. У трансгенных потомков флуоресценция в зеленой области спектра и специфическое иммуногистохимическое окрашивание внутрикожной части отдельных волосяных стержней выявлены на срезах кожи 4-6-суточных особей. При анализе волос гомозиготной особи белой окраски в синей области спектра интенсивная флуоресценция в зеленой области спектра отсутствовала, хотя тканеспецифическая экспрессия трансгена отмечена у потомков в клетках корней растущих волос.

Таким образом, наблюдаемое нами отклонение фактического генетического расщепления трансгена KERSH—EGFP в F 1 трансгенных мышей от теоретически ожидаемого, вероятно, обусловлено разной жизнеспособностью гамет и зигот у первичных трансгенных особей. Отсутствие достоверного отклонения генетического расщепления трансгена от теоретически ожидаемого у особей F 2 , полученных при скрещивании трансгенных и нетрансгенных мышей, свидетельствует о моногенном характере наследования трансгена KERSH—EGFP. Интенсивная флуоресценция отдельных волос в зеленой области спектра, наблюдаемая нами у некоторых исследованных трансгенных мышей белой масти, была обусловлена мозаичностью экспрессии EGFP, что согласуется с данными иммуногистохимического анализа препаратов кожи трансгенных особей. Тканеспецифическая экспрессия флуоресцирующего в зеленой области спектра белка (EGFP) медузы A. victoria в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос трансгенных мышей свидетельствует о функциональной активности промотора K2.10 длиной 730 п.н., контролирующего синтез белка промежуточных филаментов кератина шерсти II типа у овец. Следовательно, нуклеотидные последовательности промотора К2.10 можно использовать в экспериментах по направленной экспрессии генов у овец и животных других видов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    Г л а г о л е в П.А., И п п о л и т о в а В.М. Анатомия сельскохозяйственных животных с основами гистологии и эмбриологии. М., 1977.

• 2.    D u n n S.M., K e o u g h R.A., R o g e r s G.E. e.a. Regulation of a hair follicle keratin intermediate filament gene promoter. J. Cell Sci., 1998, 111: 3487-3496.

• 3.    S t e i n e r t P.M., R o o p D.R. Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Ann. Rev. Bio-chem., 1988, 57: 593-625.

• 4.    P o w e l l B., C r o c k e r L.A., R o g e r s G.E. Hair follicle differentiation: expression, structure and evolutionary conservation of the hair type II keratin intermediate filament gene family. Development, 1992, 114: 417-434.

• 5.    P o w e l l B.C., R o g e r s G.E . The role of keratin proteins and their genes in the growth, structure and properties of hair. In: Formation and Structure of Human Hair/Eds. P. Jolles, H. Zahn and H. Hocker. Basel, Switzerland, 1997: 59-148.

• 6.   L u c a s F. Spiders and their silk. Discovery, 1964, 25: 20-26.

• 7.   G u e r e t t e P.A., G i n z i n g a D.G., W e b e r B.H.F. e.a. Silk properties determined by gland specific

  expression of a spider silk fibroin gene family. Science, 1996, 272: 112-115.

• 8.    R o g e r s G.E., P o w e l l B.C. Organization and expression of hair follicle genes. J. Invest. Dermatol., 1993, 101: 50-55.

• 9.    K e o u g h R.A., P o w e l l B.C., R o g e r s G.E. Targeted expression of SV-40 T antigen in the hair follicle of transgenic mice produces an aberrant phenotype. J. Cell Sci., 1995, 108: 957-966.

• 10.    P r a s h e r D.C., E c k e n r o d e V.K., W a r d W.W. e.a. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Gene, 1992, 111: 229-233.

• 11.    C o r m a c k B.P., V a l d i v i a R.H., F a l k o w S. FASC — optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 1996, 173: 33-38.

• 12.    W a l t e r I., F l e i s c h m a n n M., K l e i n D. e.a. Rapid and sensitive detection of enhanced green fluorescent protein expression in paraffin sections by confocal laser scanning microscopy. Histochem J., 2000, 32: 99-103.

• 13.    М е р ф и Д., Х э н с о н Д. Получение трансгенных мышей путем микроинъекции клонированной ДНК в оплодотворенные яйцеклетки. В сб.: Новое в клонировании ДНК. Методы /Под ред. Д. Гловера. М., 1989: 308-352.

• 14.    S a i k i R.K., S c h a r f S.J., F a l o o n a F. e.a. Enzymatic amplification of b-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985, 230: 1350-1354.

• 15.    З и н о в ь е в а Н.А., П о п о в А.Н., Э р н с т Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1988.

• 16.    П о л а к Д., В а н Н о р д е н С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М., 1987.

Всероссийский НИИ животноводства,                      Поступила в редакцию 20

142132, Московская обл., Подольский р-н, п/о Дубровицы;                      января 2005 года

Институт биологии гена, Москва ;

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Москва

OBTAINING OF TRANSGENIC MICES THAT EXPRESSING THE FLUORESCENCE-BRIGHT IN GREEN SPECTRAL REGION MEDUSA PROTEIN IN THE CELLS OF FLEECE CORTICAL SUBSTANCE

M.V. Pokrovskaya, L.K. Ernst, S.G. Kadulin, V.G. Lunin, I.Ya. Shikhov, N.A. Zinov’eva

S u m m a r y

The authors have determined a functional activity of conservative K2.10 promoter control the gene of intermediate filaments of keratin of hair (II type) in sheep. For that the authors made the microinjections to pronucleus of mice zygote of genetic material with the gene of Aequorea victoria protein fluorescence-bright in green spectral region under the control of sheep’s K2.10 promoter 730 bp in length. The expression of reporter protein in fleece and differentiate cells of cortical substance of hair stem in six transgenic mices was investigated. The inheritance of transgene in mice F 1 and F 2 was estimated. It was shown, that the nucleotide sequences of K2.10 promoter may use in experiments on directed gene expression in sheeps and other animals.