Пораженность грубых кормов токсинообразующими грибами рода Fusarium

Заготовка сена и соломы высокого качества — одно из условий успешного ведения молочного и мясного животноводства как в зонах умеренного климата, так и в тропических регионах. Но если в вопросах формирования сенокосов и их оптимального использования во многих странах достигнут значительный прогресс, то проблема безопасности остается недостаточно изученной. Особую обеспокоенность специалистов вызывают сообщения о пораженности грубых кормов микроскопическими грибами, способными к токсинообразованию. Так, при обследовании сена в Канаде и Ирландии было выявлено многообразие микобиоты, представленное родами Fusarium , Aspergillus , Mucor , Absidia (1, 2). При заготовке бермутской травы Cynodon sp., одного из важнейших кормовых злаков тропиков и субтропиков, наиболее обширной оказалась популяция грибов Fusarium , которым сопутствовали Penicillium , Aspergillus , Rhizopus и Cladosporium (3).

До 1980-1990-х годов в животноводческих хозяйствах многих обла- стей и республик СССР часто диагностировали случаи фузариотоксикозов телят и овец, вызванные кормами с резко положительной реакцией в кожной биопробе, а также спорадические вспышки острых интоксикаций жвачных и лошадей, связанные с «высокотоксическими грибами» в сене и соломе (4-6). В этой связи были введены беспрецедентные меры: сено и солома, пораженные плесенью более чем на 10 % или инфицированные грибом Dendrodochium toxicum, подлежали уничтожению; для фуражных целей запрещали грубые корма, резко токсичные и токсичные по биопробе; солома и полова, пораженные Stachybotrys alternans, могли быть использованы только после обезвреживания, а грубые корма, слабо токсичные по биопробе, — исключительно как 25 % добавка к рациону (7).

В те же годы активно изучался видовой состав грибов Fusarium — на Украине (8, 9), в западных районах Белоруссии, где они преобладали в составе микофлоры клеверного сена (10), в Литовской и Армянской ССР (11, 12), на юге Казахстана, где эти грибы доминировали на сене и соломе (13), в низменной и предгорной зонах Дагестана (14). В сене из Северной Осетии было идентифицировано 19 видов и разновидностей грибов Fusarium (15), на дикорастущих кормовых злаках в южной части Большого Кавказа Азербайджана — 13 (15). Однако в РСФСР такие исследования были выполнены только на трех территориях — в Рязанской, Волгоградской областях (17, 18) и Алтайском крае (17-19), а затем практически приостановлены. Тем не менее, проблема фузариотоксикозов скота оставалась актуальной. При эпифитотии фузариоза колосовых культур в Краснодарском крае в 1985-1989 годах накопление трихотеценов группы дезоксинивалено-ла в соломе превышало их содержание в зерне (20). В 1998 году при выпасе телят поздней осенью на неубранных полях кукурузы в нескольких районах Курской области интенсивное поражение растений грибами Fusarium стало причиной острого Т-2 токсикоза (неопубликованные данные).

Недостаток в нашей стране сведений о пораженности токсинообразующими грибами сена, а также соломы злаков, которая используется на подстилку и для скармливания, сдерживает введение эффективных профилактических мер в отношении фузариотоксикозов. Судя по последним данным, для травяных кормов характерна множественная сочетанная загрязненность фузариотоксинами (21-24).

Мы впервые в России осуществили направленный поиск грибов-продуцентов токсичных трихотеценов и зеараленона в грубых кормах, результаты которого представлены в настоящей статье. Применение оригинального приема тестирования изолятов (7-суточное культивирование на зерне риса) позволило отнести к токсинообразующим 6 видов Fusarium из 11 идентифицированных в составе микобиоты. Особый интерес представляют данные по F. cerealis , F. torulosum и F. semitectum , поскольку информация относительно их токсигенного потенциала весьма ограничена.

Целью нашей работы было изучение видового состава фузариевых грибов в сене и соломе из трех областей Российской Федерации в разные годы и оценка токсинообразующей способности их популяций.

Методика. Объектами исследования служили образцы производственных партий сена и соломы из 5 районов Челябинской области, 9 районов Брянской области и 31 района Московской области, заготовленные в 1992, 2011 и 2013 годах (табл. 1). Каждый образец предварительно нарезали на фрагменты длиной около 2 см и тщательно перемешивали. Часть подготовленного материала раскладывали в три чашки Петри на поверхность агара Чапека, содержащего медицинскую консервированную желчь (10 %) и антибиотики (50 тыс. ЕД пенициллина и 100 тыс. ЕД 938

стрептомицина на 1 л среды), и помещали в термостат при 25 ° С. Через 57 сут подсчитывали число фрагментов с признаками поражения грибами Fusarium , вычисляли их долю от общего числа и начинали выделение чистых культур. Для этого колонии, относящиеся по культуральным признакам к роду Fusarium , высевали в чашки Петри с тем же агаром, а через 5-7 сут после подтверждения чистоты отсевали на косяки с картофельноглюкозным агаром (КГА). Видовую идентификацию грибов проводили по определителю (25), при необходимости использовали пособия (26, 27).

Методика оценки токсинообразования грибов включала подготовку инокулюма, субстрата, посев, культивирование, экстракцию и анализ микотоксинов. В качестве посевного материала использовали 10-суточные культуры грибов на КГА. Инокулюм примерно равного размера, взятый с поверхности агара микологическим крючком, помещали в три флакона вместимостью 10 мл и диаметром дна около 18 мм, каждый из которых содержал по 1 г стерильного дробленого зерна риса, предварительно увлажненного добавлением 1 мл воды. Флаконы закрывали ватно-марлевыми пробками, которые плотно оборачивали слоем лабораторной пленки Parafilm M^® («Pechiney Plastic Packaging», США). Культивирование проводили в темноте в течение 7 сут при 23 ° С, после чего в каждый флакон добавляли по 5 мл смеси ацетонитрил:вода в объемном соотношении 86:14, в начале и конце 14-часовой стационарной экстракции интенсивно встряхивали.

Содержания Т-2 токсина (Т-2), диацетоксисцирпенола (ДАС), дез-оксиниваленола (ДОН), зеараленона (ЗЕН) в экстрактах определяли методом иммуноферментного анализа с помощью аттестованных тест-систем (28). Нижние пределы определения составляли для Т-2 — 0,2 мкг/г риса, для остальных фузариотоксинов — 0,5 мкг/г. Для тестирования использовали изоляты Fusarium из образцов сена сбора 2014 года (Московская обл.), в их числе — все доступные культуры F. graminearum , F. culmorum , F. semitectum , F. solani , 4 изолята с уточненной идентификацией, выборки по 10 изолятов F. sporotrichioides , F. poae , F. tricinctum , F. avenaceum , составленные с соблюдением принципа рассеянного отбора, а также 12 культур F. sporotrichioides из образцов сена с высоким содержанием ЗЕН.

Полученные данные анализировали с помощью описательной статистики в программе Microsoft Excel 2013.

Результаты. В таблице 1 представлена характеристика образцов, использованных в работе.

1. Характеристика кормов из разных областей России, исследованных на пораженность грибами рода Fusarium

Место, год заготовки	Вид корма, число образцов	Ботанический состав (согласно документации заготовителя)
Челябинская область (Аргаяшский, Каслинский, Красноармейский, Ку-нашакский, Сосновский районы),	Сено, n = 56	Костер, козлятник, смесь пшеницы, овса, гороха, тимофеевка, овсяница, смесь многолетних трав, смесь сеяных трав, люцерна
1992 год	Солома, n = 4	Злаковая (в том числе ржаная)
Брянская область (Брянский, Выго-	Сено, n = 14	Злаки, луговые травы, райграсс, разнотравье
ничский, Жирятинский, Злынков-ский, Карачевский, Клинцовский, Почепский, Трубчевский районы), 2011 год	Солома, n = 5	Не указан
Московская область (31 район, исключая Красногорский, Наро-Фоминский, Люберецкий, Егорьевский, Ступинский, Луховицкий, Ба-	Сено, n = 230	Разнотравье, злаки, многолетние травы, сборное, луговое, тимофеевка, злако-бобовое, костер, люцерна, овсяница, вика, козлятник, клевер
лашихинский районы), 2013 год	Солома, n = 9	Злаковая (в том числе пшеничная, овсяная), вика-овес

Во всех 60 пробах сена и соломы из Челябинской области были выявлены фузариевые грибы, среди которых мы идентифицировали 6 видов — F. sporotrichioides Sherb., F. avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc., F. poae (Peck) Wr., F. tricinctum (Corda) Sacc., F. culmorum (W.G. Smith) Sacc. и F. sam-bucinum Fuckel. Фузарии неустановленной видовой принадлежности были найдены в сене из костра, козлятника, однолетних (смесь пшеницы, овса, гороха) и многолетних трав, а также в ржаной соломе. В 90 % проб был обнаружен F. sporotrichioides либо как единственный вид, либо вместе с другими, но, как правило, он преобладал.

Из 19 проб сена и соломы, заготовленных в Брянской области, 16 оказались поражены фузариевыми грибами 8 видов. Чаще других встречался F. sporotrichioides — 11 проб, остальные выявлялись реже: F. tricinc-tum — 4, F. equiseti (Corda) Sacc. — 3, F. poae — 2, F. solani (Mart.) Sacc. — 2 пробы, F. culmorum , F. graminearum Schw. и F. semitectum Berk. et Rav. — по одной пробе.

В кормах из Московской области грибы Fusarium были обнаружены в 171 образце из 239, то есть с частотой 71,5 %. Степень пораженности проб варьировала от 1 до 100 %, почти для половины (в 47,3 %) она составляла 1-20 %, а у пятой части превышала 50 %.

Выделенные культуры, принадлежавшие секциям Arthrosporiella , Spo-rotrichiella , Discolor и Martiella , были отнесены к 8 видам (табл. 2). Всех их обнаруживали и в обоих предыдущих сборах, и по частоте встречаемости они располагались в следующий ряд: F. sporotrichioides , F. tricinctum , F. av-enaceum , F. poae , F. culmorum , F. graminearum , F. semitectum , F. solani .

2. Пораженность сена и соломы различными видами грибов рода Fusarium (Московская обл., 2013 год)

Секция	Вид Fusarium	Частота встречаемости, % ( n = 171)	Число изолятов
Arthrosporiella	F. sporotrichioides Sherb.	85,4	265
	F. avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc.	11,1	20
	F. semitectum Berk. et Rav.	1,2	2
Sporotrichiella	F. tricinctum (Corda) Sacc.	15,2	28
	F. poae (Peck) Wr.	8,2	15
Discolor	F. culmorum (W.G. Smith) Sacc.	2,3	4
	F. graminearum Schw.	2,3	4
Martiella	F. solani (Mart.) Sacc.	0,6	1
-	Fusarium spp.	4,7	9
Примечание	. n — число исследованных проб.

Как и в кормах из Челябинской и Брянской областей, вид F. spo-rotrichioides доминировал (85,4 %), в то время как для F. tricinctum , F. aven-aceum и F. poae распространенность составляла 8-15 %, для F. culmorum и F. graminearum — 2,3 %, для F. semitectum и F. solani — соответственно 1,2 и 0,6 %. По отдельным видам не прослеживалось какого-либо соответствия с ботаническим составом сена и территорией заготовки, однако в трех случаях из четырех F. graminearum находили в сене из тимофеевки, произведенном в западных районах области (см. табл. 2).

Для четырех изолятов из группы Fusarium spp. (см. табл. 2) видовая принадлежность была установлена на основе современных таксономических систем и приемов. В результате один из них (¹ 252/3), отнесенный к F. culmorum по морфологическим признакам в системе Booth, был идентифицирован как F. cerealis (Cooke) Sacc., а второй (¹ 392/1), первоначально обозначенный как F. graminearum , — к F. torulosum (Berk. & M.A. Curtis). Из двух других грибов, принадлежность которых сначала установить не удалось, один относился к поливидовому комплексу грибов F. incarnatumequiseti (FIESC) (¹ 79/4а), другой — к виду F. sambucinum Fuckel. (¹ 79/4б). Остальные пять изолятов из группы Fusarium spp. (см. табл. 2) были за-940

грязнены грибами Penicillium , что осложнило дальнейшую работу и в итоге привело к утрате культур.

Для оценки способности грибов к токсинообразованию сформировали группы по 10 изолятов F. sporotrichioides , F. tricinctum , F. avenaceum и F. poae , а также исследовали все культуры остальных видов. Была разработана ускоренная процедура компактного культивирования грибов, которая обеспечивала условия, необходимые для их стабильного активного роста. Этого удалось добиться за 7 сут при температуре 23 ° С, использовав дробленое зерно риса (1 г), простерилизованное после увлажнения (1 мл воды), и стеклянные флаконы вместимостью около 10 см³ с ватно-марлевыми пробками, плотно обернутыми слоем лабораторной пленки для предотвращения потери влаги.

3. Токсинообразующая способность (мкг/г субстрата) у изолятов Fusarium spo-rotrichioides после 7 сут культивирования на дробленом зерне риса при температуре 23 ° С ( n = 3, X ± s )

¹ изолята Т-2 ДАС ЗЕН 9/1 327±48 1,7±0,4 50/3 348±154 1,4±0,3 0,5±0,1 54/1 290±70 1,4±0,2 1,2±0,4 236/1 408±76 1,8±0,4 276/2 396±8 3,6±0,2 324/2 1078±353 20,0±3,0 349/4 446±110 2,5±0,6 501/1 387±146 2,1±0,7 614/3 122±66 0,7±0,2 0,7±0,2 647/3 362±141 2,3±1,0 П р и м е ч а н и е. Т-2 — Т-2 токсин, ДАС диацетоксисцирпенол, ЗЕН — зеараленон; n — число по- вторностей в опыте, X — среднее арифметическое значение, s — ошибка выборочной средней. Прочерки означают, что микотоксин не обнаружен.

Все 10 исследованных изолятов F. sporotrichioides продуцировали Т-2 (122-1078 мкг/г субстрата) и ДАС (0,7-20 мкг/г) и лишь немногие — ЗЕН (3/10 изолятов, 0,5-1,2 мкг/г) (табл. 3). По-видимому, описанный ранее зарубежными исследователями случай острого дерматита коров при использовании интенсивно пораженной F. sporotrichioides овсяной соломы был вызван действием Т-2 токсина (29). Обширная пораженность сена F. sporotrichioides , активно продуцирующим Т-2 и его высокотоксичный аналог, выявлена нами на разных территориях и в разные годы. Это означает, что необходимо особое внимание к организации контроля за содержанием Т-2 в процессе заготовки и хранения корма.

4. Токсинообразующая способность (мкг/г субстрата) у изолятов Fusarium cul-morum , F. cerealis , F. graminearum, F. torulosum после 7 сут культивирования на дробленом зерне риса при температуре 23 ° С ( n = 3, X ± s )

¹ изолята	ДОН	ЗЕН
28/3	F. culmorum 5±1	57±55
258/4	55±5	256±95
266/1	10±3	88±26
505/1	9±1	12±7
252/3	F. cerealis 16±4	14±7
9/3	F. graminearum 37±21	18±8
109/2	3±1	3±1
389/1	23±14	80±79
398/1	49±29	2±1
392/1	F. torulosum 62±21	101±65
П р и м е ч а н и е. ДОН — дезоксиниваленол, ЗЕН — зеараленон; n		число повторностей в опыте, X —
среднее арифметическое значение, s —	ошибка выборочной средней.

Представители F. poae , F. аvenaceum , F. tricinctum не продуцировали Т-2 и ЗЕН. Важно отметить, что интенсивность токсинообразования у

F. sporotrichioides и F. poae в условиях быстрой оценки на зерновом субстрате совпадала с аналогичным показателем, полученным при длительном выращивании культур (30-32).

Большинство культур F. culmorum и F. graminearum , выделенных из сена, а также единичные изоляты F. cerealis и F. torulosum продуцировали ДОН и ЗЕН в количествах более 10 мкг/г (табл. 4).

Однако вряд ли совместный вклад трихотеценов группы ДОН и ЗЕН в контаминацию грубых кормов может быть существенным из-за слабой пораженности продуцентами. Тем не менее, на сочетанную загрязненность сена указывают данные исследователей в Германии (33) и Канаде (2). Обширная контаминация Т-2 токсином, НТ-2, ДОН и ЗЕН злаков и соломы урожая 2011-2012 годов выявлена на фермах Швеции (34).

Для культуры, отнесенной к комплексу грибов F. incarnatum-equiseti (¹ 79/4а), было показано слабое продуцирование ДОН (0,6±0,1 мкг/г), а ЗЕН не выявили. У изолятов F. solani (¹ 537/4) и F. sambucinum (¹ 79/4б) токсины не обнаруживали, однако изоляты F. semitectum, полученные из разных проб, активно продуцировали ЗЕН — ¹ 252/4 (77±13 мкг/г), ¹ 373/4 (110±5 мкг/г).

Быстрое культивирование на зерновом субстрате, впервые примененное в настоящей работе, позволило провести сравнительную оценку токсинообразования грибов на представительных выборках материала, что особенно важно при работе с природными популяциями. Судя по полученным результатам (см. табл. 3, 4), относительная ошибка выборочной средней при 3-кратной повторности в посевах составила 34 %, и для Т-2 и ДАС она была меньше (28 %), чем для ЗЕН (44 %). Работы по совершенствованию этой методологии, безусловно, целесообразно продолжить.

Проблема поиска источников контаминации сена ЗЕН остается весьма актуальной. В Ирландии этот токсин находили в 21 % образцов сена (2). Ранее сообщалось о случаях резкого накопления ЗЕН в сене, заготовленном в европейской части России, в том числе в Московской области (21-24). Из 6 образцов, содержащих этот токсин, были выделены 12 культур F. sporotrichioides , а в двух найдены также F. culmorum (¹ 266/1), F. tricinctum (¹ 266/3) и F. semitectum (¹ 373/4) . По результатам тестирования только 3 изолята F. sporotrichioides из 12 образовывали ЗЕН в малых количествах, F. tricinctum (¹ 266/3) не продуцировал этот метаболит, F. cul-morum (¹ 266/1) не отличался от других представителей того же рода (см. табл. 4) и только F. semitectum (¹ 373/4) был высокоактивным. Интересно отметить, что содержание ЗЕН в образце сена, из которого был получен изолят ¹ 373/4, составляло 3160 мкг/кг, а при сравнении коллекционных штаммов Fusarium на картофельно-сахарозном агаре этот вид был отнесен к числу возможных продуцентов ЗЕН (24).

Безусловно, результаты выполняемых микологических анализов растений и кормопродукции даже в первом приближении нельзя считать исчерпывающим отражением сложных и динамичных процессов, сопровождающих поражение, развитие и конкурентные взаимоотношения многочисленных представителей микобиоты, поэтому вероятность выявления причинных связей, приводящих к повышению рисков фузариотоксикозов, не так велика . Тем не менее, определение видового состава и токсигенного потенциала всего комплекса грибов Fusarium , поражающих грубые корма, остается важной задачей, поскольку среди новых видов обнаруживаются носители высокой токсичности (35). Работы по микотоксикологической оценке грубых кормов должны быть продолжены не только по группе фу-зариевых грибов. Так, способность к биосинтезу ЗЕН и его производных 942

известна для фитопатогенного гриба Drechslera portulacae (36) и грибов рода Stachybotrys (37). В обследованных нами пробах сена и соломы из Челябинской области (при высеве во влажную камеру) не были выявлены грибы из группы высокотоксигенных целлюлозоразрушителей — Stachybot-rys alternans и Dendrodochium toxicum (= Myrothecium roridum ), однако проблема загрязненности кормов их токсичными метаболитами остается актуальной. В последние годы появляются все новые сведения о распространенности таких грибов, обитающих в почвах и на растительных остатках. Недавно микобиота филлопланы кукурузы в Приморском крае пополнилась грибом Myrothecium verrucaria , который может заражать растения на ранних этапах онтогенеза (38).

Таким образом, среди фузариевых грибов, поражающих сено и солому, шесть видов способны обеспечить сочетанную загрязненность микотоксинами — Т-2 и ДАС ( Fusarium sporotrichioides ), ДОН и ЗЕН ( F. gra-minearum , F. culmorum , F. cerealis , F. torulosum ), ЗЕН ( F. semitectum ). Обширная пораженность F. sporotrichioides , выявленная на разных территориях и в разные годы, указывает на необходимость особого внимания к организации контроля этих кормов на содержание Т-2 и его высокотоксичного аналога ДАС в процессе заготовки и хранения. В дальнейшем целесообразно расширить поиск причин контаминации сена ЗЕН с учетом воздействия биогенных и антропогенных факторов, а также возможного вклада грибов, относящихся к другим таксономическим группам. Прием быстрого культивирования изолятов на зерновом субстрате, впервые примененный в настоящей работе и позволяющий проводить сравнительную оценку токсинообразования грибов на представительных выборках, перспективен для обследования природных популяций.