Потенциал бактерий рода Pseudomonas для использования в растениеводстве

Одно из приоритетных направлений Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации (утв. Указом Президента РФ от 28 февраля 2024 года № 145) – повышение экологически чистого агропроизводства, что согласуется и со Стратегией развития производства органической продукции до 2030 года (Распоряжение Правительства Российской Федерации от 4 июля 2023 года № 1788-р). При этом вопрос повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, особенно в Нечерноземной зоне России, где условия не позволяют растениям полностью реализовать свой генетически запрограммированный потенциал, является весьма актуальным.

Использование микроорганизмов и препаратов на их основе, отвечая требованиям экологизации производства, способно активизировать рост и повысить продуктивность сельскохозяйственных культур (Zia et al., 2020). Однако ассортимент биологических препаратов в настоящее время крайне мал1, а, например, доля сельскохозяйственных организаций Европейского Севера России, где применяются биологические методы защиты растений, составляет всего 9,4% (Иванов, 2023).

Цель исследования – провести анализ отечественной и зарубежной литературы и выявить основные механизмы взаимодействия бактерий рода Pseudomonas с растениями.

Задачи:

– рассмотреть основные механизмы микробно-растительного взаимодействия бактерий рода Pseudomonas;

– выявить, какие представители рода Pseudomonas перспективны для создания биологических препаратов на их основе.

Материалы и методы исследования

В качестве материалов были использованы работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению бактерий рода Pseudomonas: их биотехнологическому потенциалу, разнообразию, действию на растительные объекты и пр. Поиск анализируемых источников осуществлялся главным образом через сервис Google Scholar, который включает базы еLibrary, CyberLeninka, PubMed, JSTOR и Elsevier и пр. В поисковых запросах применялись следующие основные комбинации ключевых слов на русском и английском языках: Pseudomonas, растительно-микробные отношения, рост, продуктивность, защита растений, биопрепараты, биофунгициды, биотехнологический потенциал.

Результаты

Интерес к бактериям рода Pseudomonas прежде всего связан с их способностью синтезировать широкий спектр различных биологически активных соединений (Кулешова и др., 2006). Многие представители рода Pseudomonas относятся к бактериям PGPR-группы. Внимание к бактериям данной группы обусловлено их возможностью повышать урожайность хозяйственно значимых культур, именно поэтому данные микроорганизмы часто рассматривают в качестве альтернативы химическим средствам интенсификации агропроизводства. Почвы, на которых используются препараты с PGPR-бактериями, требуют на 50–80% меньше химических веществ, что повышает возможности для ведения экологически чистого сельского хозяйства и сохранения устойчивых систем земледелия (Максимов и др., 2011; Kumari et al., 2018; Singh et al., 2021). PGPR-бактерии синтезируют разнообразные метаболиты, которые обла- дают сигнальной и фитогормональной активностью, способностью увеличивать доступность элементов для растительных культур, а также стимулировать системную устойчивость или угнетать развитие грибных и бактериальных фитопатогенов (Максимов и др., 2011; Sah et al., 2021). Это говорит о высоком потенциале бактерий с точки зрения разработки на их основе биопрепаратов сельскохозяйственного назначения. Однако, чтобы отнести штамм к эффективным PGPR организмам, он должен обладать способностью к успешной колонизации корней, что позволит бактериям эффективно закрепиться в ризосфере. Стоит отметить, что многие неудачи в исследованиях стимулирования роста растений в полевых условиях часто коррелировали именно с плохой колонизацией бактериями корней (Choi et al., 2008; Singh et al., 2021).

Pseudomonas – это грамотрицательные палочковидные аэробные неспорообразующие бактерии, обладающие быстрым ростом и высокой колонизацией корней. Это самая большая группа PGPR, которые способны обитать в различных условиях (Kumari et al., 2018). К наиболее известным полезным для агропроизводства видам рода Pseudomonas относятся P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. putida и P. syringe (Singh et al., 2021; Singh et al., 2022).

Представители данного рода повсеместно распространены в почвенной экосистеме и являются обитателями ризосферы различных сельскохозяйственных культур, где играют одну из главных ролей в стимулировании роста растений посредством различных механизмов (Jain, Pandey, 2016). На основании анализа результатов, полученных в ходе исследований отечественных и зарубежных авторов, к основным механизмам можно отнести:

– подавление развития фитопатогенных грибов и/или бактерий (прямой и косвенный антагонизм);

– синтез метаболитов, оказывающих действие на рост и/или развитие надземных и подземных органов;

– повышение доступности минеральных компонентов для растения;

– нивелирование стрессовых факторов.

Бактерии рода Pseudomonas в подавлении развития фитопатогенных грибов и/или бактерий

Представители рода Pseudomonas способны к проявлению двух основных механизмов антагонизма: прямого и косвенного (Prabhukarthikeyan et al., 2018).

Прямой антагонизм связан со способностью бактерий синтезировать антибиотики: пиолетеорин, пирролнитрин, феназин, 2,4-диацетилфлороглюцинол (ДАФГ), цианистый водород (HCN), ка-нозамин, пиоцианин и вискозинамид (Prabhukarthikeyan et al., 2018; Sah et al., 2021). Например, ДАФГ, который способны синтезировать представители данного рода бактерий, представляет собой фенольную молекулу (Dorjey et al., 2017), а феназин – азотсодержащий гетероциклический антибиотик, обладающий активностью широкого спектра. Существуют различные производные феназина, обладающие противогрибковой активностью, но наиболее известны феназин-1-карбо-новая кислота, феназин-1-карбоксамид, 1-гидроксифеназин и др. Так, исследование феназин-продуцирующего полиэкс-тремофильного штамма P. cholororaphis GBPI 507, который выделен из ризосферы пшеницы, произрастающей в высокогорной гималайской почве, характеризуется способностью к антагонистической активности против грамположительных бактерий и актиномицетов, а также к стимулированию роста растений путем синтеза сидерофоров, аммиака и HCN (Jain, Pandey, 2016). Мутант P. aurantiaca B-162/498, который способен к повышенному уровню образования феназинов, в системе in vitro задерживал рост патогенов рода Fusarium в 1,3–1,6 раза, в условиях in planta – средняя масса проростков пшеницы увеличилась в 1,5–1,7 раза. Сходные результаты описаны в работе с генно-инженерными сверхпродуцентами антибиотиков феназинового ряда P. fluorescens z34-97 и z33-97, которые были получены путем клонирования феназинового оперона. Указанные штаммы способны к более интенсивному синтезу феназин-1-карбокси-лата, различия с исходным штаммом составляют 1,5–2,7 раза. При этом исследователи отмечают, что обработка растений данными бактериальными культурами приводит к снижению на 40% поражения пшеницы фитопатогенными грибами Gaeumannomyces graminis и Rhizoctonia solani (Феклистова, Максимова, 2008; Feklistova, Maksimova, 2008; Huang et al., 2014). Способность к синтезу пирронитри-на отмечена у штамма P. aeruginosa PS24, что способствовало подавлению развития Rhizopus microsporus, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Alternaria alternata и Penicillium digitatum (Uzair et al., 2018).

Одним из возможных путей подавления развития фитопатогенов является синтез сидерофоров. Сидерофоры – низкомолекулярные соединения, хелатирующие трехвалентное железо. В условиях ограниченного содержания железа способность некоторых представителей рода Pseudomonas приобретать ионы трехвалентного железа за счет высокого сродства сидерофоров к железу является важным конкурентным преимуществом перед другими бактериями и грибами, в т.ч. и фитопатогенами (Dorjey et al., 2017). Кроме того, в исследованиях M. Gull и F.Y. Hafeez показано, что именно синтез сидерофоров у штамма P. fluorescens Mst 8.2 выступает основным механизмом подавления R. solani (заболеваемость пшеницы снижалась до 70%) (Gull, Hafeez, 2012).

Наиболее активным из известных сидерофоров, который синтезируют представители рода Pseudomonas, является пиовердин (Vansuyt et al., 2007). Это вещество защищает растения от фитопатогенов, образуя прочный комплекс с ионами железа и переводя их в недоступную для других микроорганизмов форму. Широкий спектр антагонистической активности за счет способности синтезировать данный желто-зеленый флуоресцирующий пигмент имеют, например, штаммы P. fluorescens BKMB-896, B-24, 8305, P. putida B-37, B-40, P. vesicatoria BKMB-546, P. aureofaciens B-161, P. aurantiaca B-162, P. chlororaphis BKMB-897, 449, P. sp. 139 (Кулешова и др., 2017). Как известно, синтез пиовердина при избыточном содержании железа в среде ингибируется. Однако, исследования Ю.М. Кушлетовой с соавт. (2006) показывают, противоположное: мутанты бактерий P. putida КМБУ 4308 (уровень образования пиовердина выше в 1,6–2,0 раза по сравнению с диким типом) способны к синтезу данного сидерофора в присутствии ионов железа (Кулешова и др., 2006).

В ряде работ отмечено, что синтез цианистого водорода (HCN) играет одну из решающих ролей в подавлении роста фи-топатогенных грибов (Kumari et al., 2018). HCN вырабатывается многими ризобакте-риями, в т. ч. штаммом P. flurescens CHA0, что вызывает изменение физиологической активности растений: происходит торможение транспорта электронов, в результате чего энергоснабжение клеток нарушается, что приводит к гибели организма. Цианистый водород влияет на функционирование ферментов и естественных рецепторов посредством обратимых механизмов ингибирования, что характерно и для цитохромоксидазы (Dorjey et al., 2017).

Косвенный путь антагонизма бактерий связан с их возможностью синтезировать вещества, способные за счет передачи сигнала вызывать защитные реакции и играть решающую роль в активации генов, которые связаны с кодированием пероксидаз, полифенолоксидаз, хитиназ, глюканаз, каталаз, супероксиддисмутаз, протеиназ, липоксигеназ и лиаз. Исследования S.R. Prabhukarthikeyan и соавторов показывают, что ранняя и повышенная экспрессия пероксидаз, супероксид-дисмутаз, каталаз, протеиназ и других ферментов приводит к значительной устойчивости растений. Данные ферменты за счет их связи с лигнификаци-ей, удалением АФК, катализом окисления монофенольных и ортодифенольных соединений обладают противогрибковой активностью (Prabhukarthikeyan et al., 2018). Результаты исследований Е.Е. Акимовой и соавторов (2018) свидетельствуют, что инокуляция семян пшеницы бактериями способствовала увеличению активности пероксидазы на 9% в листьях инфицированных ростков пшеницы. Результаты позволяют говорить об обратной зависимости между активностью пероксидазы в тканях пшеницы и пораженностью растений корневой гнилью (Акимова и др., 2018).

Синтез метаболитов, оказывающих действие на рост или развитие надземных и подземных органов, представителями рода Pseudomonas

Один из путей стимуляции роста или развития растений – синтез бактериями PGPR-группы фитогормонов (Xie et al., 1996), ферментов (Safronova et al., 2006) и сидерофоров (Prabhukarthikeyan et al., 2018). Например, штамм P. fluorescens B16 способен стимулировать рост растений огурца и ячменя в тепличных и полевых условиях (Kim et al., 1998), а также томатов, арабидопсиса и острого перца. Вероятно, основным механизмом стимуляции роста растений штаммом P. fluorescens B16

является способность бактерий синтезировать пирролохинолинхинон (PQQ) (Choi et al., 2008), который действует как поглотитель активных форм кислорода (Misra et al., 2004). В исследованиях О.В. Сырмо-лот и Н.С. Кочевой показано ростостимулирующее действие экспериментального препарата, основу которого составляет ризосферная бактерия Pseudomonas sp. BZR 245-F: после обработки семян наблюдалось увеличение высоты растений по сравнению с контролем на 38,1%, количества листьев – на 4,9%, а также количества клубеньков сои на 9,8% (Сырмолот, Коче-ва, 2019).

Роль бактерий рода Pseudomonas в синтезе фитогормонов

Одной из групп фитогормонов, которая играет важную роль в регулировании роста и развития растений, является группа ауксинов. Индол-3-уксусная кислота (ИУК) – наиболее распространенный ауксин, отвечающий за регуляцию разнообразных клеточных процессов: деление и рост клеток, дифференциация сосудов, образование корней, верхушечное доминирование, тропизмы и т. д. Многие ризосферные и почвенные микроорганизмы характеризуются способностью к синтезу ИУК. Перспективными в этом отношении являются бактерии рода Pseudomonas, 80% представителей которого способны к синтезу ИУК во внешнюю среду (Dubeikovsky et al., 1993).

В исследованиях С.С. Жардецкого и соавторов показано, что обработка семян огурца ИУК-продуцирующими бактериями приводила к увеличению в 2,3–2,9 раза длины корней и в 1,6–2,0 раза массы проростков. При этом инокуляция семян штаммом P. mendocina 9–40 стимулировала корнеобразование боковых и придаточных корней (Жардецкий и др., 2005).

Не менее интересна способность бактерий к синтезу фитогормонов группы гиб- береллинов, которые могут быть полезны для стимуляции роста и нарушения покоя растений. Так, имеется опыт использования гибберелловой кислоты с целью повышения урожайности кишмишных сортов винограда и цитрусовых, увеличения вегетативной массы в луговодстве, стимуляции роста побегов чайного куста и повышения в листьях содержания танина, а также ускорения появления всходов и увеличения количества проросших глазков в картофелеводстве. И.Н. Феклистова и Н.П. Максимова показывают, что бактерии P. aurantiaca B-162 способны синтезировать гиббереллины в количестве 13,18 мг/л, а мутанты – до 31 мг/л. При этом исследователи отмечают связь уровня синтеза гиббереллинов и степени стимулирующего рост растений действия (Феклистова, Максимова, 2009). В исследованиях J.L.S. Heng и N.S.M. Zainual отмечено, что среди 50 проанализированных штаммов бактерий 35% обладали способностью синтезировать гиббереллиновую кислоту, наиболее интенсивный синтез был обнаружен у штамма P. putida PF1P (10,1 мкг/мл). Действие данного штамма привело к увеличению сырой массы и длины корня Brassica chinensis на 54,6 и 51,3% соответственно (Heng, Zainual, 2017).

Участие представителей рода Pseudomonas в повышении доступности минеральных компонентов для растений

Фосфор – один из важнейших биогенных элементов биосферы, валовые запасы которого в почве достаточно велики, однако он находится в малодоступном для растений виде (Кузьмина и др., 2016). При этом в ряде исследований показана способность бактерий рода Pseudomonas растворять фосфаты (Tiwari, Singh, 2017; Uzair et al., 2018). Так, например, отмечено, что штаммы рода Pseudomonas разрушали ортофосфат кальция на 61–74%, высокопер- спективным оказался штамм P. mandelii IB Ki-14 (Кузьмина и др., 2016).

Высвобождение фосфора из нерастворимых фосфатов объясняется главным образом выработкой органических кислот и их способностью к хелатированию. Прямое периплазматическое окисление глюкозы до глюконовой кислоты рассматривается как метаболическая основа солюбилизации неорганических фосфатов многими грамотрицательными бактериями в качестве конкурентной стратегии по преобразованию легкодоступных источников углерода в продукты, менее пригодные для использования другими микроорганизмами (Chen et al., 2006). В исследовании (Vyas, Gulati, 2009) показано, что штаммы бактерий рода Pseudomonas, которые были способны к солюбилизации фосфатов, синтезировали глюкановую, 2-кетоглюконовую, янтарную, муравьиную, лимонную, яблоневую, а также щавелевую и молочную кислоты (Van Peer et al., 1991).

Участие представителей рода Pseudomonas в повышении стрессо-устойчивости растений

Возможность бактерий PGPR-группы стимулировать иммунитет растений и ускорять их рост была открыта более 20 лет назад. Растения, обработанные ризосферными непатогенными бактериями, способны включать различные защитные ответы на стрессоры, что выражается в формировании химических и физических барьеров на пути проникновения и развития патогена, включении механизмов, позволяющих выжить в сложившихся неблагоприятных условиях, т. е. в растительном организме возникает индуцированная системная устойчивость к биотическим и абиотическим факторам (Vyas, Gulati, 2009).

Некоторые виды микроорганизмов способны ощутимо повышать порог стресса растений. Это может быть обусловлено снижением содержания этилена. Например, бактерии с помощью собственного фермента АЦК-дезаминазы способны удалять аминогруппу от молекулы 1-ами-ноциклопропан-1-карбоксилат (АЦК), которая является непосредственным предшественником этилена. Так, исследования со штаммом Р. mendocina 9-40, имеющим ген АЦК-дезаминазы, показали, что внесение его суспензии в почву снижало действие засоления на рост растений томата: длина стебля превзошла контроль в 1,1–1,6 раза, масса – в 1,2 раза. При этом увеличение негативного влияния стрессора способствовало повышению и выраженности фитопротекторных свойств изучаемого штамма. Кроме того, штамм Р. mendocina 9-40 нивелировал негативное действие солей хрома на растения томата (морфометрические параметры превосходили контроль в 2,0–3,4 раза), солей меди (в 1,0–3,5 раза) и солей свинца (в 0,7–2,4 раза) (Жардецкий, Храмцова, 2018).

В серии экспериментов И.А. Гриневой и соавторов установлено, что препараты, приготовленные на основе штаммов P. aurantiaca B-162, P. putida F19 и B. subtilis 494, способны одновременно увеличивать энергию прорастания и полевую всхожесть растений рапса в условиях высокого уровня засоления (концентрация NaCl 250 ммоль/л). Кроме того, было выражено достоверное увеличение показателей полевой всхожести рапса на 20% и длины стебля на 19% в условиях действия засоления (концентрация NaCl 150 ммоль/л), что позволяет говорить о формировании системной устойчивости (Гринева и др., 2017). Результаты исследований P. Tiwari и J.S. Singh также демонстрируют способность бактерий P. aeruginosa стимулировать рост растений пшеницы и кукурузы путем синтеза ИУК в условиях повышенного содержания хлорида натрия (концентрация NaCl 8%) (Tiwari, Singh, 2017), а T. Chu и соавторов – способность бактерий P. putida PS01 улучшать всхожесть семян (при NaCl 150 ммоль/л) и жизнеспособность (при NaCl 225 ммоль/л) арабидопси-са в условиях засоления (Chu et al., 2019).

Создание биологических препаратов на основе перспективных бактерий рода Pseudomonas

Чаще всего в качестве основы для биологических препаратов рассматривают те штаммы, которые способны одновременно оказывать защитное от фитопатогенов и стимулирующее рост действие. Например, штамм P. aeruginosa BHU B13-398 обладает сильным антагонистическим потенциалом против R. solani , способностью к солюбилизированию фосфата (1341,24 мкг/мл) и продуцированию ИУК (111,94 мкг/мл), сидерофоров, аммиака и HCN. Инокуляция данным штаммом бобовых растений показала увеличение длины побегов и корней на 33 и 85% соответственно, также наблюдалось превосходство контроля по сухой массе корней на 240%, площади листовой поверхности на 87% и содержания хлорофилла на 16% (Kumari et al., 2018).

Отметим, что результаты наших исследований суспензии штамма Pseudomonas sp. GEOT18 (были проведены лабораторные и полевые опыты в 2020–2023 гг. с ячменем, овсом, пшеницей и тритикале) также демонстрируют его высокий потенциал для растениеводства. Так, данные бактерии способны к мобилизации фосфатов, синтезу ИУК и некоторому подавлению фитопатогенов (Bychkova et al., 2022), а действие суспензии на зерновые культуры способствует активации их роста и повышению урожайности (Рассохина и др., 2020; Рассохина и др., 2022; Рассохина, Маракаев, 2023; Рассохина, Платонов, 2023).

Изучив Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской

Федерации, видно, что доля биопестицидов, созданных на основе штаммов рода Pseudomonas, невелика и составляет всего 16%. При этом среди представителей изучаемого рода в качестве основы для создания биопестицидов, как правило, использованы P. fluorescens и P. aureofaciens . Так, препарат «Бинорам», созданный на основе P. fluorescens 7Г, 7Г2К, 17-2, рекомендован для использования на пшенице, ячмене, картофеле и капусте белокочанной с целью подавления развития корневых гнилей, ризоктониоза и бактериоза, а препарат «Ризоплан» (штамм АР-33) допущен к использованию на пшенице, ячмене, сахарной свекле, картофеле, капусте, землянике, а также яблоне и винограде и позволяет бороться с развитием бурой ржавчины, септориоза, мучнистой росы, корневых гнилей, церкоспороза, пероноспороза, фитофтороза, ризоктониоза, черной ножки, бактериоза и пр. Также в каталоге отмечена эффективность P. aureofaciens штамм BS 1393 (препарат «Псевдобакте-рин-2») против плесени, корневой гнили, бурой ржавчины, септоиоза, мучнистой росы при действии на зерновые культуры, против церкоспороза при использовании на сахарной свекле, против корневых гнилей для овощей закрытого грунта. Штаммы P. aureofaciens IMBB-7096 и IMBB-7097

(препарат «Гуапсинплюс») способны подавлять развитие фузариозной и гель-минтоспориозной корневых гнилей, а также мучнистую росу у пшеницы2.

Выводы

Представители рода Pseudomonas повсеместно распространены в почвенной экосистеме и являются общими обитателями ризосферы различных сельскохозяйственных культур. К основным механизмам микробно-растительного взаимодействия представителей данного рода можно отнести подавление развития фитопатоген-ных грибов и/или бактерий (прямой и косвенный антагонизм); синтез метаболитов, оказывающих действие на рост и/или развитие надземных и подземных органов; повышение доступности минеральных компонентов для растения; нивелирование стрессовых факторов. Таким образом, бактерии рода Pseudomonas обладают высоким потенциалом для агропроизводства и могут быть использованы для создания биологических препаратов как защитного, так и ростостимулирующего действия. Наиболее интересными для реального сектора будут те штаммы, которые одновременно способны реализовывать сразу обе функции, при этом их колонизирующая способность будет высокой.