Потенциал токсинообразования мелкоспоровых видов Alternaria из зерна овса, контаминированного альтернариолом

В последние годы в мировой научной литературе активно обсуждается проблема пораженности зерна токсинобразующими грибами рода Al-ternaria , главным образом пшеницы (1-3) и ячменя (4, 5). Зерно овса, которое в виде дерти (крупного помола) широко используется в кормлении молочных коров, овец, свиней, кроликов, птицы и незаменимо в диетическом отношении для лошадей (6) изучено гораздо меньше (7). Среди токсинов грибов Alternaria особую обеспокоенность специалистов вызывает альтер-нариол (АОЛ) — метаболит дибензо-а-пиронового ряда, для которого подтверждено генотоксическое действие (8, 9).

О признаках интоксикации животных при кормлении инфицированным овсом, содержащим АОЛ, сообщалось еще в конце прошлого столетия (10). Однако в последующих работах использовали либо микологический, либо токсикологический анализы. Так, в образце овса из Греции были выявлены потенциальные продуценты A. alternata , но поиск токсина не проводили (11), а оценку встречаемости АОЛ в зерне из Швеции (12), южной части Норвегии (13), Канады (14), Ирландии (15) и Словении (16) не сопровождали микологическим анализом.

В нашей стране видовой состав грибов Alternaria был изучен на зерне из ряда областей (17, 18), а также на образцах селекционных сортов и линий из коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР), полученных в полевых опытах (19, 20), но данные по степени контаминации токсином представлены суммарно по нескольким региональным выборкам (21, 22). Недавно попытки сопоставления контаминации токсином и соотношения количеств ДНК грибов секций Alternaria и Infectoriae предприняты на нескольких образцах из Уральского региона (23) и Западной Сибири (24). Какие виды Alternaria ответственны за накопление этого токсина в зерне, до сих пор остается неясным.

В настоящем исследовании впервые установлено, что в контаминации зерна овса может участвовать вид Alternaria tenuissima (Nees et T. Nees:Fries) Wiltshire, известный как активный продуцент, и в меньшей степени представители A. arborescens E.G. Simmons и комплекса ‘ A. infectoria ’.

Цель работы — изучение видовой принадлежности и токсинообразующей способности грибов Alternaria , выделенных из зерна овса с естественной контаминацией альтернариолом.

Методика. Объектом микологического исследования был образец зерна овса посевного ( Avena sativa L.) сорта Яков, полученный в октябре 2020 года от агропредприятия, расположенного в Московской области (Одинцовский р-н). По данным иммуноферментного анализа образец был контаминирован АОЛ в количестве 630 мкг/кг и Т-2 токсином в количестве 5 мкг/кг, остальные микотоксины (дезоксиниваленол, зеараленон, фумонизины группы В, афлатоксин В 1 , стеригматоцистин, охратоксин А, цитри-нин, циклопиазоновая кислота, микофеноловая кислота, эмодин, эргоалка-лоиды, роридин А, PR-токсин) отсутствовали.

Зерна поверхностно дезинфицировали 3 % раствором формалина в течение 1,5 мин с последующей двукратной обработкой водным раствором аммиака, приготовленным посредством добавления 4 мл 5 % раствора аммиака к 1 л стерильной дистиллированной воды. Затем зерна раскладывали в чашки Петри на поверхность агара Чапека-Докса, содержащего желчь и антибиотики (25). Через 7 сут культивирования при 25 °С альтернарии отсевали в чашки Петри и после подтверждения чистоты — на косяки с агаром. Видовую идентификацию выделенных культур проводили с использованием пособий (26, 27), моноконидиальные штаммы получали как описано ранее (28). Описание цвета, структуры колоний, скорости роста культур выполняли на сахарозном агаре с дрожжевым экстрактом (yeast extract sucrose agar, YES) и картофельно-морковном агаре (potato-carrot agar, PCA) на 8-е сут.

Для экспресс-оценки способности культур продуцировать АОЛ в качестве ростовых сред использовали зерновой субстрат (овсяные хлопья), PCA, солодовый агар (malt extract agar, MEA; «Liofilchem®», Италия), сенной агар (hay infusion agar, HAY), аналог агара V-8 из овощного сока (ООО «Южная соковая компания», Краснодарский край, г. Белореченск, Россия), 568

приготовленные по соответствующей рецептуре (29). Инокулюм (10-суточные культуры на агаре Чапека-Докса) в трех повторностях помещали во флаконы вместимостью 10 мл с диаметром дна около 18 мм, каждый из которых содержал по 1,5 мл агаровых сред или по 1,0 г овсяных хлопьев с добавлением 1,0 мл воды перед стерилизацией. Флаконы закрывали ватномарлевыми пробками и обертывали слоем лабораторной пленки (Parafilm “M”® PM-996, «Pechiney Plastic Packaging», США). После инкубирования в темноте в течение 7 сут при 25 °С в каждый флакон добавляли по 1,5 или 3,0 мл (для зернового субстрата) смеси ацетонитрила и воды в объемном соотношении 84:16 и интенсивно встряхивали в начале и конце стационарной 14-часовой экстракции. Анализ экстрактов выполняли с помощью тест-системы для иммуноферментного определения АОЛ (30), предел детектирования токсина составил 0,01 мкг/г.

Данные обрабатывали с помощью описательной статистики в программе Microsoft Excel 2013, результаты выражали как средние арифметические полученных значений ( М ) с ошибкой выборочной средней (±SEM).

Результаты. В субэпидермальной микобиоте исследованного образца преобладали представители рода Alternaria : степень зараженности составила 36,0 %, им сопутствовали грибы Fusarium spp. (14,7 %) и Epicoccum spp. (2,7 %). Интенсивное инфицирование грибами Alternaria вполне согласовывалось со значительной контаминацией зерна АОЛ (630 мкг/кг), а обнаружение грибов Fusarium объясняло присутствие в нем Т-2 токсина.

1. Продуцирование альтернариола (АОЛ) представителями рода Alternaria, выделенными из зерна овса ( Avena sativa L.) сорта Яков, на зерновом субстрате (овсяные хлопья; 7 сут, 25 ° С, без освещения) ( n = 3, М ±SEM)

Регистрационный ¹ штамма             Количество АОЛ, мкг/г субстрата

	A. tenu issima
1		140±30
2		290±70
7		370±70
9		460±90
11		115±20
12		1200±70
15	A. arborescens	11±1
5		4±1
8	‘ A. infectoria ’	6±1
6		–
13		1,5±0,40
14		0,7±0,15
16		0,2±0,04
Примечание.	Прочерк означает, что АОЛ не обнаружен.

После проведения микологических процедур по выделению и идентификации культуры Alternaria были отнесены к видам A. tenuissima (Nees et T. Nees:Fries) Wiltshire (7 штаммов), A. arborescens E.G. Simmons (2 штамма) и к комплексу видов ‘A. infectoria’ (4 изолята). Ранее для зерна из пяти областей Северо-Западного региона по итогам морфологической идентификации было также показано доминирование A. tenuissima при меньшей встречаемости A. arborescens и ‘A. infectoria’ (17). Для 5 образцов зерна из двух областей Уральского федерального округа, исследованных методом количественной ПЦР, сообщалось о большей зараженности грибами секции Alternaria (40,8±5,6 %) в сравнении с представителями секции Infectoriae (2,0±1,1 %) (23). То же соотношение наблюдалось и для исследованного образца. Следует отметить, что традиционный подход к определению видовой принадлежности грибов в настоящее время признается вполне приемлемым, несмотря на все более широкое использование молекулярных методов, основанных на выявлении ДНК, таких как ПЦР в реальном времени и количественная цифровая ПЦР (31).

В эксперименте с краткосрочным выращиванием грибов на зерновом субстрате все культуры, кроме одной (‘ A. infectoria ’ ¹ 6), продуцировали АОЛ (табл. 1). Для штаммов A. tenuissima среднее по выборке количество составило 370 мкг/г, что указывает на высокий потенциал токсинооб-разования. У A. arborescens и ‘ A. infectoria ’ накопление было значительно меньшим — соответственно 5 и 1 мкг/г (см. табл. 1).

Данные, полученные для изолятов грибов Alternaria из образца, определенно указывали на то, что A. tenuissima вносили преимущественный вклад в его контаминацию токсином при совместном участии представителей A. arborescens и ‘ A. infectoria ’ . Безусловно, этот результат не может быть экстраполирован на ситуацию в целом. Для установления состава продуцентов, ответственных за контаминацию зерна овса, необходимо расширенное обследование популяции грибов, ассоциированных с этим биообъектом, организованное по принципу «один изолят—одна проба». Недавно при реализации такого формата для объемной выборки из 58 образцов была не только установлена причастность A. alternata , A. tenuissima и A. arbo-rescens к контаминации кормовой зернопродукции, но и, что особенно важно, продемонстрирована возможность использования микологических сред для тестирования грибов, а также положено начало наблюдениям за признаками соответствия между токсинообразованием и цветом, структурой колоний и скоростью роста (28). Развитие этого подхода было продолжено и в настоящем исследовании.

Результаты тестирования культур A. tenuissima , A. arborescens и ‘ A. infectoria ’ на способность продуцировать АОЛ на панели из четырех агаровых сред PCA, HAY, MEA, аналог V-8, рекомендованных для видовой идентификации (26, 27), представлены в таблице 2.

2. Продуцирование альтернариола (АОЛ) представителями рода Alternaria , выделенными из зерна овса ( Avena sativa L.) сорта Яков , на микологических агаровых средах (7 сут, 25 ° С, без освещения) ( n = 3, М ±SEM)

Регистрационный ¹ штамма	Количество АОЛ, мкг/г субстрата
	PCA	HAY	МЕА	аналог V-8
1	0,06±0,020	A. ten u issim a 2,9±0,50	40±9	0,8±0,05
2	0,9±0,05	77±8	18±2	9±3
7	0,7±0,10	36±8	11±1	5±2
9	0,9±0,30	98±1	21±3	13±3
11	15±5	16±1	38±11	2,0±0,20
12	2,5±0,30	107±27	7±1	16±5
15	–	–	–	–
5	0,4±0,20	A. arb o rescens 0,09±0,020	0,2±0,02	0,1±0,02
8	0,1±0,03	–	0,03±0,010	–
6 13		‘ A. infec to r ia ’
	–	–	–	–
14	1,3±0,90	0,08±0,030	0,1±0,02	0,03±0,006
16	0,08±0,020	–	0,03±0,003	–
Пр и м еч ани е. Прочерки означают,		что АОЛ не обнаружен.

На всех средах АОЛ продуцировали 6 штаммов A. tenuissima. Накопление токсина как между штаммами, так и на разных средах, варьировало от 0,06 до 107 мкг/г. У одного из штаммов (¹ 15) токсин детектировать не удалось. О неравномерности биосинтеза АОЛ у A. tenuissima сообщалось ранее (28), и эту особенность связывали с внутривидовыми различиями, которые не удавалось выявлять по морфологическим признакам (32). В целом интенсивность накопления АОЛ у A. tenuissima оказалась наибольшей на средах HAY и MEA (56 и 23 мкг/г) и была на 1-2 порядка меньше, чем на зерне (см. табл. 1). Такое же снижение от 300 мкг/г (на зерне) до 26 мкг/г (на MEA) было отмечено ранее для штамма A. tenuissima Al 392, изолированного из овса (33).

Культуры A. arborescens продуцировали АОЛ гораздо слабее, чем представители A. tenuissima . На HAY и V-8 его удалось детектировать только у штамма ¹ 8. На средах PCA и MEA количество токсина варьировало от 0,03 до 0,4 мкг/г (см. табл. 2) и, как и у A. tenuissima , значительно уступало значениям в варианте с зерновым субстратом. Ранее у трех штаммов A. ar-borescens из зерна пшеницы и семян подсолнечника было отмечено более интенсивное накопление АОЛ на MEA — от 3,3 до 36 мкг/г (34), у пяти культур из зерновых кормов и трех коллекционных штаммов — от 2 до 79 мкг/кг (28). К сожалению, из-за малого числа изолятов, доступных для изучения, объем сведений по потенциалу биосинтеза АОЛ у этого вида, остается недостаточным.

Представители комплекса видов ‘ A. infectoria’ по токсинообразова-нию на агаровых средах различались попарно (¹ 6, ¹ 13 и ¹ 14, ¹ 16) — первые два не образовывали токсин, у других он был обнаружен. У обоих изолятов способность к продуцированию была выявлена только на PCA и MEA в сопоставимых количествах соответственно 0,08-1,3 и 0,03-0,1 мкг/г.

Обобщение этих данных показывает, что из всех испытанных микологических сред коммерческая среда МЕА обеспечивала устойчивый положительный метаболический ответ для культур A. tenuissima , A. arborescens и ‘ A. infectoria ’, поэтому может быть рекомендована, наряду с зерновым субстратом, для оценки in vitro их биосинтетического потенциала в расширенном формате.

По морфологическим характеристикам все штаммы A. tenuissima были типичными: имели неразветвленные цепочки, состоящие из 5-10 шиловидных конидий с удлиненной шейкой, плотно-бархатистые колонии темно-серого цвета с черной обратной стороной и умеренную скорость роста на PCA и YES. Каких-либо особенностей по цвету, структуре колоний и скорости роста у единственного непродуцирующего штамма ¹ 15 выявлено не было. Учитывая обнаружение АОЛ при его культивировании на зерновом субстрате, хоть и в наименьшем количестве (см. табл. 1), можно допустить его биосинтез и на агаровых средах, но в концентрациях ниже 0,01 мкг/кг, то есть за пределом определения метода.

Описание культурально-морфологических признаков штаммов A. ar-borescens со слабым спороношением и изолятов ‘ A. infectoria ’, у которых спо-роношения добиться не удалось, приведено в таблице 3.

3. Культурально-морфологические признаки штаммов Alternaria arborescens и изолятов комплекса видов ‘ A. infectoria’ , выделенных из зерна овса ( Avena sa-tiva L.) сорта Яков, на двух агаровых средах на 8-е сут выращивания

Регистрационный ¹ штамма	Структура, цвет и диаметр (d) колоний
	PCA          1                 YES
	A. arborescens
5	Бархатистая, темно-серая      Плотно-бархатистая с отчетливыми концентриче скими кругами, серая, обратная сторона почти черная, d = 47 мм
8	Бархатистая, светло-серая,      Плотно-бархатистая, серая, обратная сторона почти в центре темно-серая          черная, d = 39 мм ‘ A. infectoria ’
6	Рыхло-пушистая, темно-серая  Слабопушистая, розово-бело-серая, обратная сторона почти черная, d = 55 мм
13	Рыхлая, тяжистая, светло-серая Рыхло-пушистая, бело-розовая, обратная сторона серая, d = 39 мм

Продолжение таблицы 3 14                 Войлокоподобная, темно-серая Плотная, бархатистая, бело-розовая со слабо выра женными концентрическими кругами, обратная сторона коричневатая, d = 40 мм

16                 Войлокоподобная, светло-серая Плотная, бархатистая, бело-розовая, обратная сто- в центре, серая по краям       рона коричневая, d = 50 мм

Пр им еч ан и е. Описание условий культивирования см. в разделе «Методика».

Колонии A. arborescens на PCA и YES практически не различались по размерам и внешнему виду, но у штамма ¹ 5, который, в отличие от ¹ 8, продуцировал токсин на всех четырех средах (см. табл. 2), на YES были хорошо заметны концентрические круги. У представителей ‘A. infec-toria’ колонии также были примерно одинаковыми (с диаметрами 39-55 мм), но попарно различались по плотности (¹ 6, ¹ 13 и ¹ 14, ¹ 16) (см. табл. 3) и по способности к токсинообразованию (см. табл. 2). Изолят ¹ 6, резко отличающийся от всех остальных окраской воздушного мицелия и реверса на YES, не образовывал токсин на агаровых средах (см. табл. 2) и на зерновом субстрате (см. табл. 1). У парного с ним изолята ¹ 13, который не продуцировал АОЛ на агаровых средах, но синтезировал его на зерне, признаков культурального сходства с продуцентами ¹ 14, ¹ 16 было больше. Максимальное накопление АОЛ (1,3 мкг/г, PCA) обеспечивал изо-лят ¹ 14, на плотной бархатистой колонии которого наблюдались концентрические круги (см. табл. 3).

О способности продуцировать АОЛ изолятами ‘ A. infectoria’ из зерна овса сообщается впервые. Известно о продуцирующей способности грибов этого комплекса из зерна пшеницы, но нет подробного описания их мак-роморфологических признаков. Так, для штамма российского происхождения показано образование АОЛ в количестве 2,01 мкг/г (35), для 12 штаммов из Италии — в диапазоне от 0,3 до 20 мкг/г со средним значением 4 мкг/г (36), для 98 % изолятов в Аргентине — в количестве от 1,8 до 433,3 мкг/г со средним содержанием 62,2 мкг/г (37). О морфотипах ‘ A. infectoria’ , различающихся характером пигментации, впервые сообщалось в работе B. Kosiak с соавт. (38). Недавно для атипичного изолята ‘ A. in-fectoria’ из семян подсолнечника с особенностями в структуре колонии и повышенной скоростью роста было показано продуцирование АОЛ на агаровых средах в количествах от 2 до 220 мкг/г (28). Продолжение изучения токсинообразования и культуральных свойств грибов этой систематически сложной группы остается актуальным и важным для уточнения ряда таксономических аспектов (39, 40).

Таким образом, для ряда штаммов Alternaria arborescens и изолятов комплекса ‘ A. infectoria ’, выделенных из зерна овса сорта Яков, описаны соответствия между макроморфологическими характеристиками и способностью продуцировать альтернариол. При сравнительном изучении интенсивности биосинтеза альтернариола грибами A. tenuissima , A. arborescens и ‘ A. infectoria ’ на панели агаровых сред, рекомендованных для видовой идентификации, показано, что для расширенных форматов токсикологического мониторинга целесообразно использовать коммерческий солодовый агар, наряду с твердым зерновым субстратом. Установлено, что преимущественный вклад в контаминацию образца зерна альтернариолом вносит вид A. tenuissima , в меньшей степени — представители A. arborescens и комплекса ‘A. infectoria’ . В дальнейшем целесообразно предпринять развернутую оценку популяций мелкоспоровых видов Alternaria , ассоциированных с зерном овса, по аналогичной комплексной методической схеме, включающей микологический и токсикологический анализ.