Предварительные результаты изучения антителогенеза у барсуков при экспериментальном туберкулезе

Laboratories Agency, Великобритания, где были проведены два экспериментальных исследования эффективности оральной вакцинации барсуков против туберкулеза. Суть этих работ заключается в следующем.

Эксперимент 1. Вакцинация барсуков (опытная группа, n=3: оVS1-67, оVS1-71, оVS1-94) проводилась орально введением через пищевод в дозе 1х10⁸ КОЕ M.bovis штамма BCG Danish 1331 (Statens Serum Institut, Дания) в жидком виде в фосфатно-буферном растворе. Животные контрольной группы (n=2: кVS1-29, кVS1-37) получили плацебо. Спустя 17 недель после вакцинации все животные (контрольной и опытной групп) подвергались экспериментальному заражению интрабронхиально в дозе 3х10² КОЕ культуры полевого штамма M.bovis AF 2122/97, выделенного в Великобритании. Для изучения антителогенеза к микобактериальным антигенам нами были исследованы пробы крови барсуков, которые были взяты в ходе данного эксперимента за 2 недели до и через 4, 8 и 12 недель после заражения.

Эксперимент 2. Вакцинация проводилась аналогично описанной в эксперименте 1, при этом животные опытной группы А (n=6: оаVS2-101, оаVS2-313, оаVS2-546, оаVS2-564, оаVS2-591, оаVS2-862) получили вакцину в высокой дозе (1х108 КОЕ), а группы Б (n=8, обVS2-126, обVS2-284, обVS2-304, обVS2-343, обVS2-346, обVS2-619, обVS2-779, обVS2-816) – в низкой (1х105 КОЕ). Барсуки контрольной группы (n=4: кVS2-118, кVS2-123, кVS2-547, кVS2-811)

получили плацебо. Спустя 17 недель после вакцинации все животные (контрольной и опытных групп) подвергались экспериментальному заражению как описано выше. Нами были исследованы пробы крови, которые были взяты у барсуков в ходе второго эксперимента в день и спустя 6 и 15 недель после вакцинации, а также через 2, 6, 8, 12 и 16 недель после заражения, с целью изучения антителообразования к антигенам M.bovis .

Антигены для проведения серологических исследований. Рекомбинантные антигены (rESAT-6, rCFP-10, rRv3616c, rPPDb, rMPB70, rMPB83, rpAF1, rpJ) и синтетический пептид антигена MPB70 (pep1-MPB70), использованные в этом исследовании, были получены по описанной ранее методике [9], и их характеристики тоже описаны [1]. Вкратце, рекомбинантные белки экспрессировались в клетках Escherichia coli (N-концевое слияние белков с полигистидином (6xHis)) и очищались до почти гомогенного состояния в Fusion Antibodies Ltd. (Северная Ирландия). Синтетические пептиды были смоделированы, используя базу данных Standard Protein BLAST Центра биотехнологической информации NCBI [8], и синтезированы согласно нашему дизайну в Genosphere Biotechnologies (Франция). Пептиды смешивали с различными буферными растворами в зависимости от их биохимических свойств [1], аликвоты хранили при -20°C. Количественное определение проводили методом анализа содержания белка с использованием микробицинхониновой кислоты (Pierce, Rockford, IL). Антигены наносили в лунки микропланшет, используя роботизированный прибор BioDot3400 [9] в количестве до 10 точек в одной лунке с концентрацией 1-30мкг/мл, объемом 20нл каждый.

Постановка мультиплексного иммуноанализа. Мультиплексный анализ с использованием сенсибилизированных микропланшет проводили согласно ранее описанной методике [9] со следующей оптимизацией для использования с сыворотками крови барсука. Пробы в разведении 1:450 (в буферном растворе Enfer A) в объеме 50мкл вносили в лунки микропланшет, с последующей инкубацией в шейкер-инкубаторе в течение 90 мин при 21°С. Планшеты промывали буферным раствором с Твином-20. Антивидовые антитела (антитела против иммуноглобулинов барсука класса G – «CF2/HRPo IgG-HRP», производства VLA, Великобритания) в разведении 1:100'000 (в буферном растворе Enfer В) в объеме 50мкл вносили в лунки микропланшет, с последующей инкубацией в шейкер-инкубаторе в течение 30 мин при 21°С. Планшеты промывали, как описано выше, и в лунки вносили 40мкл хемилюминесцентного субстрата. Читку реакции и обработку результатов проводили на ридере для мультиплексного анализа с применением специального программного обеспечения как было описано ранее [9]. Уровень антител выражался в относительных световых единицах (ОСЕ), который улавливается в диапазоне от 0 до 65000.

Результаты. В таблицах 1 и 2 показано количество антигенов, к которым антитела выявлялись на уровне более 3000 ОСЕ (условный порог) у каждого отдельно взятого животного в динамике патогенеза до и после заражения культурой полевого штамма M.bovis AF 2122/97. В сыворотках крови барсуков 1 и 2 экспериментов до заражения антитела к антигенам pep1-MPB70, rRv3616c, rMPB83 не выявлялись, что проявлялось уровнем свечения ниже 1000 ОСЕ. Единично животные реагировали к другим антигенам. Низкие показания зафиксированы к антигенам rPPDb (оаVS2-564), rMPB70 (оаVS2-591 и оаVS2-862) и rpJ (оаVS2-101 и обVS2-343) с уровнем антител менее 3000 ОСЕ. К остальным антигенам отмечался средний уровень – к rESAT-6 (кVS2-118 – до 2900 ОСЕ и обVS2-284 – до 18000 ОСЕ), к rCFP-10 (обVS2-284 – до 25000 ОСЕ) и к rpAF1 (обVS2-343 – до 17000 ОСЕ).

Таблица 1 - Интенсивность антителогенеза к разным микобактериальным антигенам у барсуков эксперимента 1

Идентификационный номер животного	Количество микобактериальных антигенов, антитела к которым обнаруживались на уровне выше 3000 ОСЕ, по срокам
	2 недели до заражения	4 недели после заражения	8 недель после заражения	12 недель после заражения
кVS1-29	0	3	6	6
кVS1-37	0	3	6	6

оVS1-67	0	3	3	3
оVS1-71	0	6	6	6
оVS1-94	0	6	6	6

После заражения антителообразование к различным микобактериальным антигенам проявлялось по-разному. К синтетическому пептиду pep1-MPB70 антитела выявились только в одном случае. У животного оаVS2-101 через 2 и 6 недель после экспериментального заражения культурой M.bovis AF 2122/97 антитела выявлялись на уровне 5100 и 3100 ОСЕ соответственно. Аналогичная ситуация отмечена в отношении rPPDb, когда антитела обнаруживались только у одного животного оаVS2-313 (рис.1) на 8 и 12 неделю после заражения с уровнем 4300 и 8100 ОСЕ соответственно. В двух случаях выявлялись антитела к антигену rpJ, причем у животного обVS2-343 (рис.2) они варьировали на протяжении всего исследования в пределах от 3500 до 7200 ОСЕ, в том числе и в период до заражения, а специфический антителогенез отмечен только у барсука оаVS2-313, когда антитела обнаруживались спустя 8 недель после заражения на уровне 6600 ОСЕ, с подъемом до 18600 ОСЕ к 12 неделе и последующим спадом до 8500 ОСЕ к 16 неделе.

Таблица 2 - Интенсивность антителогенеза к разным микобактериальным антигенам у барсуков эксперимента 2

IS и и о S У св и S S н и о У S о о М	Количество микобактериальных антигенов, антитела к которым обнаруживались на уровне выше 3000 ОСЕ, по срокам
	о ч (D ГС (D И ЕЯ	О S У и см св	(D Г[ (D И СЧ К к ей ей со О	(D И СЙ СО (D	(D И ОО « со (D	Ч (D гс (D И сч 1 со	Ч (D Г[ (D И Ю « ей СО
кVS2-118	0	0	1	6	6	6	6
кVS2-123	0	0	0	3	6	6	6
кVS2-547	0	0	0	4	6	6	6
кVS2-811	0	0	0	6	6	6	6
оаVS2-101	0	0	1	7	6	6	6
оаVS2-313	0	0	0	4	8	8	7
оаVS2-546	0	0	0	3	6	6	6
оаVS2-564	0	0	0	2	6	6	6
оаVS2-591	0	0	0	6	6	6	6
оаVS2-862	0	0	0	3	6	6	6
обVS2-126	0	0	0	4	6	6	6
обVS2-284	0	2	0	3	6	6	6
обVS2-304	0	0	0	2	6	6	6

обVS2-343	1	1	1	4	6	6	7
обVS2-346	0	0	0	6	6	6	6
обVS2-619	0	0	0	2	6	6	6
обVS2-779	0	0	0	4	6	6	6
обVS2-816	0	0	0	3	6	6	6

Рис.1. Антителогенез у барсука оаVS2-313

Рис.2. Антителогенез у барсука обVS2-343

У животных контрольной группы 1-го эксперимента (кVS1-29 и кVS1-37), которые не подвергались вакцинации, антитела к антигенам rESAT-6, rCFP-10 и rpAF1 выявлялись с 4-й недели после заражения и достигали уровня 8300-26200 ОСЕ. Антителогенез к rRv3616c, rMPB70 и rMPB83 отмечался через 8 и 12 недель после введения полевого штамма (15300-34100 ОСЕ). Аналогичная ситуация наблюдалась с животными контрольной группы 2-го эксперимента (кVS2-118, кVS2-123, кVS2-547, кVS2-811), когда антитела улавливались на диагностическом уровне спустя 6, 8, 12 и 16 недель после заражения, а уровень их достигал 44000-65000 ОСЕ.

У животных опытной группы 1-го эксперимента (оVS1-67, оVS1-71, оVS1-94) антитела к различным антигенам выявлялись с 4-й недели, причем у барсука оVS1-67 только к ранним антигенам rRv3616c, rESAT-6 и rCFP-10 до уровня 9600-12000 ОСЕ, а у двух других до 32000-65000 ОСЕ, в том числе и к rpAF1, rMPB70 и rMPB83. У барсуков опытных групп 2-го эксперимента наблюдалась аналогичная картина, при этом зависимости результатов от дозы вакцины не наблюдалось.

Обсуждение результатов. По завершению экспериментов 1 и 2, животные подвергались эвтаназии и постмортальным исследованиям, в результате которых инфицирование было выявлено у всех животных

опытных и контрольной групп, что указывает на отсутствие формирования поствакцинального иммунитета у барсуков на фоне описанной выше оральной вакцинации. Однако пробы сывороток крови от этих животных явились уникальным материалом для проведения исследования микобактериальных антигенов с целью выявления наиболее диагностически значимых. Антигены, секретируемые микобактериями на ранних стадиях развития туберкулеза (ESAT-6, CFP-10, Rv3616c), показывали высокую активность в случаях с другими видами животных [2,3,4], что также подтвердилось и в данных исследованиях с барсуками. Антителогенез к более поздним антигенам был закономерным, в особенности к MPB70, MPB83, и менее выраженным к PPDb и к новым исследованным pAF1 и pJ. Несмотря на то, что pep1-MPB70 показал высокую активность при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота [5], у барсуков он оказался малоэффективным.

Заключение. Инфекционный процесс при туберкулезе барсуков характеризуется интенсивным антителообразованием к микобактериальным антигенам. Выявлена высокая диагностическая значимость таких антигенов как rESAT-6, rCFP-10, rRv3616c, rMPB70, rMPB83 и rpAF1. А антигены rPPDb, rpJ и pep1-MPB70 оказались малоэффективными.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Шуралев Э.А. Микобактериальные антигены: синтетические пептиды и рекомбинантные белки // Ученые записки КГАВМ

– 2013. – Т.216. – С.403-407. 2. Шуралев Э.А. Сравнительный анализ тест-систем для диагностики туберкулеза у альпак // Ветеринарный врач. – 2012. – №5. – С.30-33. 3. Шуралев Э.А., Мукминов М.Н., Валеева А.Р., и др. Мультиплексный ИФА с хемилюминесцентной меткой для диагностики туберкулеза у кабанов // Ветеринария. – 2013. – №2. – С.25-28. 4. Шуралев Э.А., Мукминов М.Н., Велан К., Кларк Дж. Выявление специфических антител у вапити при туберкулезе // Ветеринария. – 2013. – №8. – С.54-57. 5. Шуралев Э.А., Ндайишимийе Э.В., Мукминов М.Н. К вопросу серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Ученые записки КГАВМ. – 2012. – Т.211 – С.202-206. 6. Шуралев Э.А., Ндайишимийе Э.В., Мукминов М.Н., и др. Факторы риска и индикация Mycobacterium bovis на территориальном уровне // Ученые записки КГАВМ. – 2013. – Т.215. – С.367-371. 7. Fitzgerald S.D., Kaneene J.B. Wildlife reservoirs of bovine tuberculosis worldwide: hosts, pathology, surveillance, and control // Vet Pathol. – 2013. – V.50, №3. – P.488-499. 8. Standard Protein BLAST [Электронный ресурс] // URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov (дата обращения 03.11.2014). 9. W helan C., Shuralev E., O'Keeffe G., et al. Multiplex immunoassay for serological diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. // Clin Vaccine Immunol. – 2008. – V.15, №12. – P.1834-1838.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ АНТИТЕЛОГЕНЕЗА У БАРСУКОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ

Шуралев Э.А.

Резюме

Используя мультиплексный иммуноанализ изучены микобактериальные антигены и выявлены наиболее эффективные для диагностики туберкулеза у барсуков. Установлена высокая диагностическая значимость таких антигенов как rESAT-6, rCFP-10, rRv3616c, rMPB70, rMPB83 и rpAF1.

PRELIMINARY RESULTS OF THE STUDY OF BADGER ANTIBODY RESPONSE UNDER EXPERIMENTAL TUBERCULOSIS

Shuralev E.A.