Применение амилолитических и протеолитических ферментов для получения β-глюкана из ячменя

Глюканы, в зависимости от источника выделения, представляют собой полимеры, отличающиеся молекулярной массой и конфигурацией [1, 2]. В природе широко распространены α-D-глюканы и β-D-глюканы, но также встречаются и смешанные α,β-D-глюканы [3]. Глюканы также классифицируют в зависимости от распределения гликозидных связей вдоль цепи; положения пиронозного кольца; ветвления и молекулярной массы. С помощью модификации возможно получение различных производных глюкана для применения в фармацевтической и пищевой промышленности [4].

В последние годы глюканы, а именно их β-форма, привлекли внимание ученых. По- вышенный интерес к β-глюкану обусловлен его способностью снижать гликемический индекс продуктов путем образования в желудочно-кишечном тракте вязких гелей, замедляющих всасывание сахаров [5–8]. Кроме того, последние исследования выявили способность β-глюкана оказывать иммуномодулирующее действие, а также снижать вероятность возникновения и развития опухолей [9]. Следует также отметить антиоксидантные свойства β-глюкана, позволяющие использовать его в производстве продуктов питания с целью увеличения их срока хранения [10, 11]. Особого внимания заслуживает способность β-глюкана оказывать стимулирующее влияние на процессы регенерации через активацию кератиноцитов и фибробластов. Противоал- лергические свойства β-глюкана позволяют использовать его в производстве продуктов питания для широкого круга потребителей [12, 13].

Совокупность полезного эффекта, оказываемого β-глюканом на здоровье человека при его регулярном потреблении, способствовало повышению интереса производителей пищевых продуктов к β-глюкану, как компоненту продуктов питания [14–16]. В частности, с недавнего времени компанией «Компани Жерве Данон» выпускается ферментированный молочный продукт с β-глюканом [15]. В свою очередь, компания «Тропикана про-дактс» разработала и выпустила линейку соков с β-глюканом [16].

β-глюкан обнаружен как в сырье растительного происхождения (ячмень, овес, пшеница), так и микробного (клеточные стенки дрожжей). Из растительного сырья, в качестве источника β-глюкана, наибольший интерес представляет ячмень. Содержание β-глюкана в нем может достигать 20 %, причем в клеточных стенках эндосперма на его долю приходится до 75 % от общей массы веществ [12, 17, 18].

С целью применения в пищевой промышленности наибольший интерес представляет хорошо отчищенный β-глюкан. Наличие посторонних примесей в β-глюкане способно оказать негативное влияние на органолептические показатели продуктов питания, придавая им несвойственный вкус и аромат [9].

Целью данной работы является получение β-глюкана из ячменя посредством применения комплекса ферментов амилолитического и протеолитического действия и оценка его качества.

Для достижения поставленной цели необходимо:

– выделить β-глюкан из ячменя с использованием комплекса ферментов;

– оценить качество полученного β-глю-кана.

Объекты и методы исследований

В качестве объекта исследования был выбран ячмень сорта Челябинский 99. Сырье измельчали с использованием лабораторной мельницы ЛЗМ-1 и просеивали. Полученную ячменную муку кипятили в течение 6 часов в 80 %-ном растворе этилового спирта, десятикратно превышающим массу навески. Затем в полученную смесь вводили гидроксид натрия (1М) и выдерживали в течение 90 минут при температуре 45 °С на плитке при непрерывном помешивании. Полученную смесь центрифугировали, рН надосадочной жидкости доводили до 7, а затем поочередно обрабатывали комплексом амилолитических и протеолитических ферментов. Качество β-глюкана оценивали по содержанию посторонних примесей с использованием общепринятых методов исследования: содержание крахмала методом Эверса по ГОСТ 10845–98; моно- и дисахариды – ГОСТ 15113.6–77; содержание жира экстракционно-весовым методом с использованием аппарата Сокслета – ГОСТ 29033–91; содержание общего азота с пересчетом на общий белок по коэффициенту 6,25 методом Къельдаля – ГОСТ 10846–91; определение золы гравиметрическим методом – ГОСТ 15113.3–77; определение нерастворимых и растворимых пищевых волокон ферментативно-гравиметрическим методом – ГОСТ Р 54014–2010.

Исследования проводились в лаборатории по контролю качества продуктов питания кафедры «Технология и организация питания» Южно-Уральского государственного университета (НИУ), в лаборатории ФГУ Центра химизации и с/х радиологии; в аккредитованном Испытательном лабораторном центре ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области».

Результаты и их обсуждение

Компоненты ячменя. Как правило, цельнозерновой ячмень состоит из примерно 70 % крахмала, 10–20 % белка, 5–10 % β-глюкана, 2–3 % липидов и около 2,5 % минеральных веществ [3–7].

Белок ячменя. Ячмень богат запасными белками – проламинами (hordeins). Они могут быть классифицированы в зависимости от их молекулярной массы и расположения. А-Hordeins имеют молекулярную массу 12–26 кДа; молекулярная масса В-Hordeins находится в пределах 36–45 кДа; С-Hordeins – в пределах 59–72 кДа; D-Hordeins – 100 кДа. В целом, белки ячменя не являются полноценными, но тем не менее, включают в себя ряд незаменимых и полузаменимых аминокислот: треонин, валин, лизин и аргинин [4].

Ячменный крахмал. Крахмал является основным компонентом эндосперма ячменя. Меньше всего крахмала содержится в алейроновом и субалейроновом слоях, а также в тканях зародыша [6].

Липиды ячменя. Неполярные липиды ячменя – триацилглицериды, состоят преимущественно из моно- и диацилглицерола, а также свободных жирных кислот, тогда как полярные липиды в основном представлены фосфолипидами. Линолевая кислота (50–60 %), пальмитиновая (20–30 %), олеиновая (10–15 %) и линоленовая кислоты (4–9 %) составляют основу липидов ячменя. Часть липидов находится внутри крахмальных гранул, расположенных в эндосперме ячменя. Другая их часть локализована в ядре зерна и представлена преимущественно пальмитиновой (46 %) и линолевой (34 %) кислотами [3, 6, 12].

Минералы ячменя. Зольность ячменя обычно находится в диапазоне 2–3 %. Минеральный состав ячменя представлен фосфором, калием и кальцием, в то время как хлор, магний, сера и натрий содержатся в меньших количествах. Самая высокая концентрация минералов обнаружена в зародыше, самая низкая – в эндосперме [8–13].

Пищевые волокна ячменя. Пищевые волокна классифицируются на растворимые и нерастворимые. Из анализа публикаций по данной теме, растворимые волокна можно обозначить как съедобные части растений или аналогичные углеводы, устойчивые к перевариванию и всасыванию в тонком кишечнике человека с полной или частичной ферментацией в толстом кишечнике. В отличие от растворимых, нерастворимые пищевые волокна проходят желудочно-кишечный тракт, не будучи переваренными и лишь способствуют нормализации функции кишечника [9–11].

β-глюкан. В последние годы потенциал использования β-глюкана из ячменя и других источников в качестве функционального пищевого ингредиента привлек к себе внимание научного сообщества. Продукты питания с β-глюканом отнесены к функциональным. Являясь структурообразователем, он способен придавать продуктам желаемые свойства и консистенцию, оказывая влияние на текстуру конечного продукта. β-глюкан – это более общее название (1/3,1/4)-β-D-глюканов. β-глюкан состоит из гомополимеров D-глюкопиранозильных остатков, обычно содержащих две (cellotriose) или три (cellotetraose) β-(1/4) связи, разделенные одной β-(1/3) связью. Молекулярная структура β-глюкана была изучена путем анализа олигомеров, полученных в результате расщепления β-глюкана с использованием специфиче- ских ферментов, способных разрушать связи между D-глюкопиранозил единицами. Примерно 90–95 % от олигосахаридов, образованных в процессе пищеварения, являются трисахаридами (3-О-β-D-cellobiosyl-D-glucose) и тетрасахаридами (3-О-β-D-cellotriosyl-D-glucose), а остальные 5–10 % представлены преимущественно олигосахаридами. β-глюканы, выделенные из различных злаков, имеют примерно одинаковую молекулярную структуру, но отличаются соотношением β-(1/4)/β-(1/3) связей. Они также могут отличаться соотношением трисахариды/ тетрасахариды, а также молекулярной массой. Ячмень обычно содержит 2–10 % β-глюкана, но в некоторых сортах его содержание может достигать 20 %. В клеточных стенках эндосперма ячменя на долю β-глакана приходится 75 % общей массы полисахаридов. Остальные 25 % распределяются между arabinoxylans, целлюлозой, glucamannans и белками [4, 16].

Суть эксперимента сводилась к последовательной обработке ячменной муки этанолом, гидроксидом натрия и ферментами амилолитического и протеолитического действия, что способствовало ослаблению межмолекулярного взаимодействия β-глюкана с другими компонентами растительных тканей, представленных преимущественно крахмалом и белками (см. рисунок).

В результате эксперимента были получены кристаллы β-глюкана. Цвет кристаллов – белый с желтым оттенком. Проведены исследования химического состава β-глюкана, полученного путем поочередной обработки подготовленного сырья комплексом амилолитических и протеолитических ферментов. Эксперименты проведены в трехкратной повторности с вычислением среднего арифметического значения трех параллельных экспериментов. Результаты исследования химического состава кристаллов β-глюкана представлены в таблице. Расчет показателей выполнен на сухое вещество.

Среди посторонних примесей, обнаруженных в кристаллах β-глюкана, наибольшая доля (4,88 %) приходится на белок. Следует отметить, что содержание белка в исследуемых образцах превышает сумму крахмала, моно- и дисахаридов, сырого жира и золы вместе взятых. Содержание крахмала и золы в образцах примерно одинаково. Основным компонентом исследуемых кристаллов являлись пищевые волокна, на долю которых при- ходится 91,4 % от общей массы образцов. Содержание растворимых волокон, преимущественно β-глюкана, в 5,6 раз превышает содержание нерастворимых.

Относительно невысокое содержание посторонних примесей в исследуемых кристаллах β-глюкана обусловлено применением термостабильной α-амилазы в комплексе с ферментами протеолитического действия.

Ячмень (зерно)

I

Измельчение

I

Просеивание (размер частиц менее 0,5'10”3 м)

I

Кипячение в 80 % растворе этилового спирта в соотношении 1:10 (Т = 360 мин)

Добавление раствора NaOH (1М) в соотношении 7:1 (к массе муки)

*

Перемешивание на горячей плитке с магнитной мешалкой (Т = 90 мин, 1 = 45 °C)

I

Це нтр и фу гиро ва н и е

(w = 15 000 мин1; Т = 15 мин; 1 = 20 °C)

I

Доведение надосадочной жидкости до pH = 7 лимонной кислотой

I

Обработка надосадочной жидкости термостабильной а-амилазой (t > 40 °C; Т= 180 мин)

I

Центрифугирование

(w = 15 000 мин-1; Т = 20 мин; 1 > 40 °C)

I

Обработка надосадочной жидкости комплексом протеолитических ферментов (1>37°С;Т = 180 мин)

Це нтр и фу ги ро ва ние

(w = 22 000 мин-1; Т - 20 мин; 1-4 °C)

I

Смесь надосадочной жидкости и этилового спирта (80 %) в соотношении 1:2 выдерживают в течение 15 мин

I

Центрифугирование

(w = 22 000 мин-1; Т = 20 мин; 1 = 4 °C)

I

Высушивание надосадочной жидкости в вакуумной печи (содержание сухих веществ не менее 96 %)

Показатели качества кристаллов β-глюкана

Химический состав, %	Значение показателя качества
Углеводы:	2,12 ± 0,02
крахмал	1,47 ± 0,02
моно- и дисахариды	0,65 ± 0,02
Пищевые волокна:	91,4 ± 0,04
растворимые (в том числе β-глюкан)	77,6 ± 0,04
нерастворимые	13,8 ± 0,04
Сырой жир	0,36 ± 0,01
Белки	4,88 ± 0,02
Зола	1,24 ± 0,01

Заключение

Таким образом, в результате применения ферментативного метода гидролиза, заключающегося в попеременной обработке подготовленного сырья амилазой и комплексом протеолитических ферментов, были получены кристаллы с содержанием растворимых пищевых волокон, преимущественно β-глюкана, 77,6 % на сухое вещество.

Известно, что термин «растворимые пищевые волокна» включает целый ряд химических соединений. Для определения точного количества β-глюкана необходимо проведение дополнительных исследований, выходящих за рамки данной работы.