Применение обогатительно-селективной среды для культивирования сальмонелл

Автор: Чугунова Елена Олеговна

Журнал: Вестник Омского государственного аграрного университета @vestnik-omgau

Статья в выпуске: 2 (22), 2016 года.

Бесплатный доступ

Рассмотрены преимущества разработанного состава питательной среды для обогащения сальмо- нелл по сравнению с аналогом. Основой для создания питательной среды послужила забуференная пеп- тонная вода, в которую перед бактериальным посевом добавляли пропиленгликоль. Работа выполнена на базе Пермского ветеринарного диагностического центра в период с 2014 по 2015 г. В процессе исследо- ваний использовали референтные культуры Salmonella spp., Sh. flexneri, E. coli, Pr. vulgaris, S. aureus иL. monocytogenes. В результате выявлена существенная разница в скорости размножения бактерий рода Salmonella при культивировании. Предложенная среда способствовала увеличению чистой культуры сальмонелл в среднем на 38,57 %. При культивировании Salmonella spp. в ассоциации с сопутствующей микрофлорой был также получен прирост бактериальной массы сальмонелл в опыте на 15,04-61,54 %. Исключение составило культивирование со штаммами S. choleraesuis. Чистые культуры данных штаммов показали прирост бактериальных клеток в опытных образцах на 8,97 % больше, чем в контрольных.В ассоциации с другими микроорганизмами как контрольные, так и опытные пробы были примерно оди- наковой мутности. Однако количество бактериальных клеток было большим и составило 1,3 х 108. Таким образом, предложенный состав обогатительной питательной среды может быть с успехом применим в ветеринарных лабораториях, так как позволяет выделять в короткие сроки Salmonella spp.

Еще

Сальмонеллы, сопутствующие микроорганизмы, питательные среды, обогащение, бактериальная биомасса

Короткий адрес: https://sciup.org/142199178

IDR: 142199178

Текст научной статьи Применение обогатительно-селективной среды для культивирования сальмонелл

Пищевые сальмонеллезы – широко распространенные болезни людей, их регистрируют во всех странах, на всех континентах. Возбудители поражают человека и длительное время сохраняются в окружающей среде [1]. Вместе с тем, растущий темп жизни общества отражается на его питании. Быстрые способы приготовления еды, полуфабрикаты из супермаркетов требуют все большего внимания к мерам профилактики и гигиены [2].

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в пищевых продуктах в незначительном количестве вместе с большим числом других бактерий [3]. Для изоляции сальмонелл из продуктов питания используют несколько групп сред: обогатительные, селективные и идентифи-

кационные. Обогатительные среды содержат минимальное количество селективных агентов и отличаются высокой питательностью [4], что способствует развитию как Salmonella spp., так и сопутствующей микрофлоры. Известно, что выделение чистых культур микроорганизмов значительно осложняется, если в микробной ассоциации присутствует протей, способный к роению (Покровский В.И., 1985). Для подавления роения протеев обычно используют различные химические вещества (Cowan S.T., Steel K.J., 1974). Они в ряде случаев ингибируют и рост искомых микроорганизмов [5]. В связи с этим актуальна разработка обогатительноселективной среды, способствующей увеличению биомассы сальмонелл при подавлении сопутствующей микрофлоры.

Объекты и методы

Объектом исследования служили референтные штаммы S. typhimutium, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum, S. dublin, S. choleraesuis, S. infantis, S. hamburg, S. virchow, Sh. flexneri , E. coli , Pr. vulgaris , S. aureus , L. Monocytogenes , полученные из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России и выделенные из мясной и яичной продукции. Исследования проводили, используя суточные агаровые культуры изучаемых микроорганизмов. Исходную бактериальную суспензию, содержащую 1 х 10⁸ МТ/см³ или 0,5 ед. мутности по МакФарланду (McF), готовили с помощью оптического прибора Densi-La-Meter (Erba Lachema, Чехия). Далее делали ряд последовательных разведений до получения рабочей суспензии, содержащей 1 х 10¹ МТ/см³, которую использовали для культивирования в забуфе-ренной пептонной воде (ЗПВ), приготовленной по ГОСТ 31659‒2012 (контроль) и в питательной среде, предложенной автором (опыт).

При разработке обогатительно-селективной среды в стандартную ЗПВ добавляли пропи-ленгликоль (1,2 пропиленгликоль, пропандиол-1,2) «чистый» [6]. В испытуемую и контрольную питательную среду инокулировали взятые в опыт микроорганизмы и инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. На следующий день устанавливали прирост бактериальной массы по степени мутности на приборе Densi-La-Meter. Мутность бактериальной суспензии выражали в единицах МакФарланда (McF).

Опыты проводили в 10-кратной повторности. Статистический анализ результатов исследования проведен в программе Statistica 6.0 с использованием методов вариационной статистики [7]. Вычисляли средние величины (М), их стандартную ошибку (m) и среднеквадратическое отклонение ( σ ). Достоверность различий между показателями оценивали с использованием непарного t-критерия Стъюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты статистической обработки в таблицах представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m).

Результаты исследований

Установлена способность разработанной питательной среды влиять на скорость размножения сальмонелл. Визуально испытуемая среда после инкубации с бактериями рода Salmonella была более мутной, чем ЗПВ контрольных образцов. Измерив степень мутности контрольных и опытных образцов ЗПВ на оптическом анализаторе DensiLaMeter, подтвердили свойство разработанной среды катализировать процесс увеличения биомассы сальмонелл (табл. 1).

Таблица 1

Прирост бактериальной массы Salmonella spp. при культивировании в питательных средах

Серотип сальмонелл	Степень мутности, ед. McF		Прирост бактериальной массы
Серотип сальмонелл	Опыт	Контроль	Абсолютное значение, ед. McF	%
S. typhimurium	1,838 ± 0,09¹	1,013 ± 0,035	0,825	44,89
S. Dublin	1,1 ± 0,053¹	0,913 ± 0,099	0,187	17,00
S. choleraesuis	0,725 ± 0,089³	0,66 ± 0,05	0,065	8,97
S. enteritidis	1,11 ± 0,064¹	0,675 ± 0,046	0,435	39,19
S. gallinarum-pullorum	1,538 ± 0,052¹	1,05 ± 0,053	0,488	31,73
S. infantis	2,163 ± 0,052¹	0,963 ± 0,052	1,2	55,48
S. hamburg	2,388 ± 0,035¹	0,8 ± 0,0	1,588	66,50
S. virchow	1,738 ± 0,09¹	0,96 ± 0,052	0,778	44,76
Среднее значение	1,568 ± 0,56²	0,879 ± 0,15	0,70	38,57

1Р < 0,001; 2Р < 0,01; 3Р < 0,05.

При анализе полученных результатов установлено, что разработанный состав питательной среды для этапа предобогащения сальмонелл сопровождается приростом бактериальной массы. Прирост бактериальной массы в опытных образцах среды для серотипов S. typhimurium, S. infantis, S. virchow составил более 40 % по сравнению с контролем. Наибольшая степень размножения отмечена при культивировании штаммов серотипа S. hamburg – 66,50 %. Однако штаммы S. choleraesuis показали слабую способность ферментировать пропиленгликоль, что отразилось на результате: прирост бактериальной массы бактерий в опытной среде оказался выше всего на 8,97 %, чем в контрольной.

Определенный интерес вызывает способность исследуемой питательной среды влиять на размножение кишечной палочки, протея, шигелл, золотистого стафилококка и листерий. После 24-часовой инкубации контрольных и опытных образцов ЗПВ со штаммами вышеперечисленных микроорганизмов оказалось, что разработанная среда в разной степени ингибирует размножение данных бактерий (табл. 2).

Таблица 2

Прирост бактериальной массы при культивировании ассоциации микроорганизмов в питательных средах

Вид микроорганизмов	Степень мутности, ед. McF		Прирост бактериальной массы
Вид микроорганизмов	Опыт	Контроль	Абсолютное значение, ед. McF	%
Р. vulgaris	0,488 ± 0,064¹	0,613 ± 0,064	–0,125	–20,39
E. coli	0,775 ± 0,046¹	0,975 ± 0,046	–0,2	–20,51
S. aureus	0,588 ± 0,035¹	0,713 ± 0,035	–0,125	–17,53
L. monocytogenes	0,025 ± 0,046	0,038 ± 0,052	–0,013	–34,21
Sh. flexneri	0,3 ± 0,0¹	0,663 ± 0,052	–0,363	–54,75

1Р < 0,001.

Опытная ЗПВ тормозит размножение золотистого стафилококка на 17,53 %, литерий на 34,21 %, шигелл – более чем на 50 %. По результатам исследований выявлено свойство испытуемой среды сдерживать прирост бактериальной массы протея и кишечной палочки на 20 %. Данный факт имеет огромное значение в повседневной лабораторной практике, так как часто именно БГКП и рода Proteus подавляют развитие сальмонелл, что приводит к ложноотрицательным результатам исследований.

Для объективности оценки полученных данных провели посев ассоциации микроорганизмов на разработанную неселективную среду. Для этого сальмонеллы и взятые в опыт штаммы прочих микроорганизмов в равных количествах (по 1 х 10¹ МТ/см³) инокулировали в опытные и контрольные флаконы с ЗПВ (табл. 3) .

Очевидна позитивная роль испытуемой среды для неселективного размножения сальмонелл. Прирост бактериальной массы сальмонелл в опытных образцах был на 13,64–64,89 % больше, чем в контроле. Наглядно результаты данного опыта отражены на рисунке.

Влияние испытуемой питательной среды на размножение сальмонелл в ассоциации с другими видами микроорганизмов, ед. мутности McF

Таблица 3

Прирост бактериальной массы сальмонелл в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами

Вид микроорганизмов	Степень мутности, ед. McF		Прирост бактериальной массы
Вид микроорганизмов	Опыт	Контроль	Абсолютное значение, ед. McF	%
		S. typhimurium	+
Р. vulgaris	1,73 ± 0,095¹	1,08 ± 0,079	0,65	37,80
E. coli	1,70 ± 0,082¹	1,07 ± 0,082	0,63	37,06
S. aureus	1,73 ± 0,082¹	1,12 ± 0,079	0,61	35,26
L. monocytogenes	1,74 ± 0,052¹	1,10 ± 0,082	0,64	36,78
Sh. flexneri	1,72 ± 0,079¹	1,08 ± 0,079	0,64	37,21
Среднее значение	1,72 ± 0,018¹	1,09 ± 0,02	0,63	36,63
S. Dublin +
Р. vulgaris	1,11 ± 0,088¹	0,93 ± 0,048	0,18	16,22
E. coli	1,16 ± 0,052¹	0,96 ± 0,052	0,20	17,24
S. aureus	1,16 ± 0,052¹	0,99 ± 0,032	0,17	14,66
L. monocytogenes	1,10 ± 0,0¹	0,95 ± 0,053	0,15	13,64
Sh. flexneri	1,14 ± 0,07¹	0,96 ± 0,07	0,18	15,79
Среднее значение	1,13 ± 0,03¹	0,96 ± 0,02	0,17	15,04
S. choleraesuis +
Р. vulgaris	0,63 ± 0,048	0,63 ± 0,048	0,0	0,0
E. coli	0,66 ± 0,052	0,69 ± 0,088	–0,03	–4,55
S. aureus	0,63 ± 0,048	0,65 ± 0,053	–0,02	–3,17
L. monocytogenes	0,64 ± 0,052	0,62 ± 0,042	0,02	3,13
Sh. flexneri	0,62 ± 0,042	0,64 ± 0,048	–0,02	–3,23
Среднее значение	0,64 ± 0,015	0,65 ± 0,03	–0,01	–1,54
S. enteritidis +
Р. vulgaris	1,13 ± 0,082¹	0,80 ± 0,082	0,33	29,20
E. coli	1,15 ± 0,07¹	0,86 ± 0,084	0,29	25,22
S. aureus	1,16 ± 0,052¹	0,72 ± 0,079	0,44	37,93
L. monocytogenes	1,09 ± 0,057¹	0,83 ± 0,067	0,26	23,85
Sh. flexneri	1,12 ± 0,079¹	0,69 ± 0,074	0,43	38,39
Среднее значение	1,13 ± 0,03¹	0,78 ± 0,07	0,35	30,97
S. gallinarum-pullorum +
Р. vulgaris	1,70 ± 0,07¹	1,03 ± 0,048	0,67	39,41
E. coli	1,51 ± 0,074¹	1,05 ± 0,071	0,46	30,46
S. aureus	1,49 ± 0,074¹	1,07 ± 0,067	0,42	28,19
L. monocytogenes	1,55 ± 0,053¹	1,04 ± 0,052	0,51	32,90
Sh. flexneri	1,57 ± 0,067¹	1,04 ± 0,07	0,53	33,76
Среднее значение	1,56 ± 0,08¹	1,046 ± 0,015	0,514	32,95
S. infantis +
Р. vulgaris	1,99 ± 0,074¹	0,97 ± 0,067	1,02	51,26
E. coli	1,92 ± 0,042¹	0,94 ± 0,052	0,98	51,04
S. aureus	1,91 ± 0,64²	1,06 ± 0,052	0,85	44,50
L. monocytogenes	2,11 ± 0,033¹	1,06 ± 0,053	1,05	49,76
Sh. flexneri	2,11 ± 0,074¹	1,02 ± 0,079	1,09	51,66
Среднее значение	2,008 ± 0,1¹	1,01 ± 0,05	0,998	49,70
S. hamburg +
Р. vulgaris	2,20 ± 0,115¹	0,84 ± 0,052	1,36	61,82
E. coli	2,13 ± 0,142¹	0,89 ± 0,088	1,24	58,22
S. aureus	2,30 ± 0,082¹	0,89 ± 0,074	1,41	61,30
L. monocytogenes	2,18 ± 0,132¹	0,82 ± 0,079	1,36	62,39
Sh. flexneri	2,25 ± 0,07¹	0,79 ± 0,057	1,46	64,89
Среднее значение	2,21 ± 0,07¹	0,85 ± 0,04	1,36	61,54
S. virchow +
Р. vulgaris	1,73 ± 0,576²	0,96 ± 0,052	0,77	44,51
E. coli	1,83 ± 0,082¹	0,99 ± 0,057	0,84	45,90
S. aureus	2,02 ± 0,103¹	0,97 ± 0,048	1,05	51,98
L. monocytogenes	1,87 ± 0,082¹	0,98 ± 0,079	0,89	47,59
Sh. flexneri	1,86 ± 0,052¹	0,97 ± 0,082	0,89	47,85
Среднее значение	1,86 ± 0,1¹	0,97 ± 0,01	0,89	47,85

Заключение

Таким образом, выявлена существенная разница между скоростью размножения бактерий рода Salmonella при культивировании в опытных и контрольных образцах питательной среды. Разработанная среда способствовала увеличению чистой культуры сальмонелл в среднем на 38,57 %. При работе с Salmonella spp. в ассоциации с сопутствующей микрофлорой также получили прирост бактериальной массы сальмонелл в опытных образцах. Причем разница биомассы сальмонелл составила от 15,04 до 61,54 % в пользу испытуемой питательной среды. Исключение составили образцы со штаммами S. choleraesuis. Чистые культуры данных штаммов показали прирост бактериальных клеток в опытных образцах на 8,97 % больше, чем в контрольных. При работе с S. choleraesuis в ассоциации с другими микроорганизмами как контрольные, так и опытные пробы были примерно одинаковой мутности, однако количество бактериальных клеток составило 1,3 х 10⁸. Принимая во внимание тот факт, что разрешающая способность бактериологического метода составляет 1 х 10⁵ МТ/см³ [8], а экспесс-методов около 1 х 10⁵–10⁶ МТ/см³ [9], разработка может быть с успехом применима в испытательных лабораториях.

Список литературы Применение обогатительно-селективной среды для культивирования сальмонелл

Сагабиева, Н.Н. Эпизоотологический мониторинг сальмонеллеза крупного рогатого скота в Курской области: дис. … канд. вет. наук/Н.Н. Сагабиева. -2004. -135 с.
Слаусгальвис, В. Сальмонеллез: меры борьбы и контроль/В. Слаусгальвис//Животноводство России. -2010. -№ 2. -С. 60-61.
Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки: cправочник/С.А. Артемьева, Т.Н. Артемьева, А.И. Дмитриев, В.В. Дорутина. -М.: Колос, 2002. -288 с.
Шуляк, Б.Ф. Руководство по бактериальным инфекциям собак: в 2 ч./Б.Ф. Шуляк. -М.: ОЛИТА, 2003. -608 с.
Султанов, З.З. Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред: дис. … д-ра биол. наук/З.З. Султанов. -Махачкала, 2008. -271 с.
Приемопередающее устройство: пат. 2570386 Рос. Федерация. № 2014136524/15; заявл. 08.09.2014; опубл. 10.12.2015. Бюл. № 34. -5 с.
Мастицкий, С.Э. Методическое пособие по использованию программы Statistica при обработке биологических исследований. -Минск/С.Э. Мастицкий. -Минск: РУП «Институт рыбного хозяйства», 1987. -79 с.
№ 63Fricker, C.R. The isolation of salmonellas andcampylobacters/C.R. Fricker//AppI Bact. -1987. -№ 63 (2). -С. 99-116.
Пашкова, А.П. Совершенствование элективных питательных сред и биологические свойства свежевыделенных эшерихий и сальмонелл: дис. … канд. биол. наук. -Курск, 2006. -С. 50-54.

Еще

Статья научная