Применение реакции канцеролиза для первичного скрининга противоопухолевой активности продуктов лечебного питания

В настоящее время доклинические испытания потенциальных противоопухолевых агентов представляют собой длительный и высокозатратный процесс. С целью сокращения времени и средств применяются различные методы преддоклини-ческого отбора (скрининга) потенциальных противоопухолевых агентов, чтобы в последующих полномасштабных онкологических экспериментах исследовать лишь наиболее действенные агенты. Однако в отличие от собственно доклинических испытаний преддоклинические исследования не стандартизированы, и разные лаборатории используют для этого различные подходы, вследствие чего данные исследований не всегда сопоставимы между собой. Кроме того, большинство таких методов предусматривает испытания in vitro (в культурах клеток и др.), что не всегда дает адекватную информацию о действии тех же веществ in vivo и, во всяком случае, не дает возможности предсказать их оптимальные дозы и схемы применения in vivo.

В связи с этим в нашем институте проводятся исследования, направленные на создание комплекса методов ускоренного скрининга, которые дают возможность быстро и при сравнительно небольших затратах оценить широкий спектр веществ, доз и схем их применения. В частности, для скрининга потенциальных лечебных агентов, для которых не предусматривается прямое цитотоксическое действие на клетки опухолей, а также для скрининга пищевых продуктов, потенциально предназначенных для лечебного и повседневного питания онкологических больных, нами применяются методы согласно патентам [4–6]. В основе методов [4–6] лежит оригинальная модификация

• [4]    известной реакции канцеролиза (неиммунного цитолиза опухолевых клеток сывороткой или плазмой крови) [2], которая многократно повышает точность, воспроизводимость, диагностическую и прогностическую ценность этой реакции.

Целью исследования является оценка информативности предлагаемого метода скрининга путем анализа соотношений между изменениями канцеролитического индекса сыворотки крови здоровых животных и изменениями скорости роста трансплантированных животным опухолей.

Материалы и методы

Канцеролитическую реакцию (КЛ-реакцию) проводили в соответствии с патентом [1], учитывающим следующие ее особенности, выявленные в наших предшествующих исследованиях: 1) КЛ-реакцию, обусловленную главным образом не экзогенной перфорацией клеточной мембраны, а программированной смертью клеток (аутофагией или апоптозом), индуцируемой цитокинами сыворотки; 2) необходимость сохранения интактного экстрацеллюлярного матрикса для адекватного реагирования клеток на цитокины; 3) концентрацию клеток-мишеней в реакционной смеси, которая формируется как результирующая процессов собственно цитолиза и деления клеток, в связи с чем в динамике она изменяется квазипериодически, причем величина периода зависит от спектра цитокинов в реакционной смеси и в реальных опытах не может быть предсказана заранее для каждого образца.

Реакцию проводили в 96-луночных круглодонных серологических планшетах (в отличие от классической методики [2], использующей гематологические меланжеры, что исключало последующее внесение останавливающего раствора). Рабочие разведения (1:100) сыворотки крови интактных животных (нелинейных мышей или крыс) или здоровых животных того же вида, пола и возраста, получавших на протяжении 7 сут испытуемый пищевой продукт (в соответствии с патентом [5]), а также рабочую суспензию (2 млн клеток/мл) клеток-мишеней – клеток асцитного рака Эрлиха готовили на изотоническом растворе натрия хлорида. В отличие от классической методики [2], клетки-мишени не отмывали от асцитной жидкости центрифугированием, во избежание утраты нативного экстрацеллюлярного матрикса. В каждую рабочую лунку вносили сначала 100 мкл рабочего разведения сыворотки, а затем 100 мкл рабочей суспензии клеток-мишеней. В каждом рабочем ряду лунок для каждого образца сыворотки формировали таким способом (в отличие от классической методики) 4 лунки с идентичной реакционной смесью. После этого планшеты инкубировали в термостате при 37°C. После окончания времени инкубации (30 мин – для первой лунки каждого ряда, 60 мин – для второй, 90 мин – для третьей, 120 мин – для четвертой) реакцию останавливали (в отличие от классической методики), внося в лунки по 10 мкл насыщенного раствора бихромата калия, после чего содержимое лунки тщательно пи-петировали и подсчитывали концентрацию клеток в нем с помощью камеры Горяева. По окончании подсчета клеток в четвертых лунках всех рядов эти показатели суммировали для каждого ряда в отдельности и на основании полученных сумм вычисляли канцеролитический индекс (КИ) каждого опытного образца относительно интактного контроля по формуле: (сигма контроля – сигма опыта) / (сигма контроля). В случае снижения концентрации суспензии (преобладание цитолиза) КИ положителен, при преобладании деления клеток (увеличение концентрации суспензии) – отрицателен.

Экспериментальные опухоли . Агенты, вызвавшие у здоровых животных повышение канцеролитической активности сыворотки более чем на 10 %, а также агенты, вызвавшие снижение канцеролитической активности, испытывали в полномасштабных онкологических экспериментах, проводимых по общепринятому стандарту. При подборе штаммов экспериментальных (перевиваемых) опухолей и методов их трансплантации руководствовались методическими рекомендациями [1, 8], определяющими стандарты проведения доклинических испытаний противоопухолевых агентов. В табл. 1 для каждого рассмотренного опыта указан использованный в нем штамм. Результаты оценивали: для солидных опухолей – по массе опухолей на момент забоя животных; для асцитных опухолей – по количеству опухолевых клеток на 1 животное на момент забоя.

Животные . Выбор вида, линии, пола и возраста подопытных животных для экспериментов с перевиваемыми опухолями осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями [1, 8]. Скрининг (в соответствии с патентом [5]) испытуемых продуктов по их влиянию на КЛ-активность

ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ КАНЦЕРОЛИЗА ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО СКРИНИНГА ...

сыворотки крови осуществляли на здоровых нелинейных мышах и/или крысах приблизительно 2-месячного возраста.

Испытуемые агенты. В настоящем сообщении представлены данные об испытаниях следующих пищевых продуктов: экстракта зеленого чая, приготовленного в соответствии с международным стандартом ISO 6079 (ЗЧ); его наномодификации, полученной путем повторного растворения стандартного экстракта ЗЧ в воде и последующей распылительной сушки при пропускании через особо тонкие форсунки (Нано-ЗЧ); наномодификаций композита из экстрактов зеленого чая и компонентов красного вина (Нано-ЗЧВ) [9], а также нанокомпозита из зеленого чая, компонентов красного вина и цедры лимона (Нано-ЗЧВЛ) [10], полученных аналогичным способом; сыроподобного соевого продукта, полученного из цельных соевых бобов и подвергнутого термообработке текучим водяным паром в течение 40 мин (СПТ); аналогичного соевого продукта, подвергнутого термообработке в течение 3 мин (СПС); черничной пасты, полученной по технологии С.Б. Осипенко [7]. Все продукты были предоставлены нам для биологических испытаний разработчиками-изготовителями: продукты на основе зеленого чая – Институтом биохимии и биотехнологии им. С. Дурмишидзе ААН Грузии; СПТ и СПС – Институтом пищевой химии и технологии НАН Украины; черничная паста – Научно-производственным частным предприятием «Институт «ТЕКМАШ», Украина.

Продукты на основе зеленого чая животные получали в виде 0,1 % раствора в питьевой воде; соевые продукты – в виде смеси со стандартным комбикормом для грызунов из расчета 25 % соевого белка в общем белке кормовой смеси; черничную пасту – в виде смеси 1,7 г пасты на 80 г стандартного комбикорма.

Статистическая обработка данных. Статистическую значимость различий между группами животных определяли с помощью точного метода Фишера в интерпретации [3], т. е. относя все инди-

Таблица 1