Применение смесей моно- и олигоэпоксидных соединений для консервации биологических протезов клапанов сердца

Ю.А. Кудрявцева, И.Ю. Журавлева, Л.А. Опарина*, М.Я. Хилько*, Б.А.Трофимов*, Л.С. Барбараш

ГУ «Научно-производственная проблемная лаборатория реконструктивной хирургии сердца и сосудов с клиникой СО РАМН», Кемерово

* Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, Иркутск

Цель исследования - оценка эффективности применения новых препаратов из класса эпоксисоединений в качестве консерванта биологических протезов клапанов сердца. В эксперименте были использованы створки аортальных клапанов свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля (ДЭЗ) и смесями различных эпоксисоединений - СМ1, СМ2 и СМ3. Комплексная оценка свойств биоматериала показала, что смеси моно- и олигоэпоксидов являются эффективными консервантами биологических протезов клапанов сердца. Изучение кальций-связывающей активности в эксперименте показало, что ксеностворки, обработанные всеми исследуемыми консервантами, устойчивы к накоплению кальция. В сравнении с индивидуальным ДЭЗ, биоматериал, консервированный эпоксидными препаратами, более активно связывает гепарин, что должно позитивно сказаться на антитромбогенных свойствах биологических протезов. Дальнейшее совершенствование способов консервации биологических протезов клапанов сердца на основе эпоксидных смесей СМ1, СМ2 и СМ3 является перспективным направлением.

Использование эпоксидных соединений для консервации биоматериала позволяет получить кардиоваскулярные ксенопротезы с высокой биосовместимостью, достаточно высокой прочностью и антитромбогенными свойствами [1-4,11]. Эпоксисоединения представлены широким спектром препаратов, как моно-, так и полимерных. В России с этой целью успешно применяют диглицидиловый эфир этиленгликоля [1,3, 5, 11]. Основным преимуществом консервации биологического материала эпоксидами является высокая резистентность биопротезов к кальцификации [1,4, 12]. Этот феномен обусловлен структурой химических связей, образуемых эпоксигруппами с коллагеновой матрицей [1]. В то же время различия молекулярной структуры эпоксисоединений, широко варьирующей в пределах химического класса эпоксидов, оказывают несомненное влияние на консервирующие свойства каждого конкретного представителя данного класса.

Большое внимание в последние годы уделяется возможности применения полиэпоксид-ных препаратов, так как данные соединения более перспективны в плане дополнительной модификации биоматериала за счет высокого содержания эпоксигрупп в разветвленной карбоновой цепи полиэпоксидов [6, 7, 11, 13, 14]. Поэтому поиск новых оригинальных эпоксидных соединений для консервации биоматериалов является актуальной задачей. В настоящем исследовании представлены результаты комп лексной оценки биосовместимости и сшивающей активности новых комплексных эпоксидных препаратов в сравнении с применяемыми в практике ДЭЗ и глутаровым альдегидом (ГА).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперименте были использованы створки аортальных клапанов свиньи, применяемые при изготовлении биологических протезов клапанов сердца. Для консервации биоматериала применяли глутаровый альдегид («Reanal», Венгрия), диглицидиловый эфир этиленгликоля (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН) [4] и оригинальные эпоксидные препараты СМ1, СМ2 и СМ3, представляющие собой смеси ДЭЭ, В2 и В4 (рис. 1) в различных соотношениях [6]. Препараты В2 и В4 синтезированы в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН по разработанному новому общему принципу синтеза эпоксидных смол нового поколения [8-10, 15]. Для комплексной оценки качества консервации биоматериала были использованы: аминокислотный анализ, физико-механические исследования и гистологическое изучение структуры биоматериала.

Для выполнения аминокислотного анализа в качестве контрольных служили образцы соответствующих нативных тканей. Образцы отмывали в 0,5 л дистиллированной воды при постоянном помешивании в течение 1 ч с 3-кратной

а

б

Me

Me

O

O

O

O

O Me

O

e Me

O

O

Me

O

O

O

O

O

Me

O

O

Рис. 1. Химическая структура эпоксисоединений: а - диглицидиловый эфир этиленгликоля; б - В ₂ - Ди-1-[2-(глицидилокси)этокси]этиловый эфир диэтиленгликоля; в - В₄ - 1,2,3,4,6-Пента-О-{1-[2-(глицидилок-си)этокси] этил}-а-0-глюкопираноза .

сменой воды, после чего лиофильно высушивали. Гидролиз высушенных образцов проводили в 6 N соляной кислоте в запаянных ампулах при 110 °C в течение 24 ч. После упаривания соляной кислоты сухой остаток растворяли в литий-цитратном буфере, центрифугировали и использовали супернатант для аминокислотного анализа.

Определение проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе «Hitachy-835» (Япония). Для каждой аминокислоты осуществлен расчет относительного содержания ее остатков, приходящихся на 1000 аминокислотных остатков белков исследованного образца.

Физико-механические испытания проведены в условиях продольного растяжения однотипно подготовленных образцов. Образцы в виде «лопаток» со стандартной длиной L вырезали из биоматериала с помощью специального ножа, согласно ГОСТ 11262-80. Эксперименты выполнены на разрывной машине «Instron 5582» (Англия). По результатам испытаний расчитывали следующие показатели: h - средняя толщина образца (мм), s - разрушающее напряжение при растяжении (МПа) и Е - относительное удлинение (%).

Структуру биоматериала исследовали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилин-эозином. Приготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Гистологические препараты исследовали при помощи микроскопа МИКМЕД-2 («ЛОМО», Санкт-Петербург).

Кальций-связывающую активность исследовали in vivo, путем подкожной имплантации образцов биоматериала крысам линии Vistar на 60 суток. По окончании эксперимента удаленные образцы отмывали в 0,9% растворе натрия хлорида, после чего высушивали до постоянной массы. Гидролиз образцов проводили на песочной бане в растворе 50% хлорной кислоты. Количество кальция определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Perkin Elmer, 5100», USA) и расчитывали на 1 мг сухой ткани.

Количество иммобилизованного гепарина определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности раствора о-толу-идинового синего после взаимодействия с образцами. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре UV/Vis Ultraspec Plus (LKB-Pharmacia).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы MS Excel. Расчитывали значение средней арифметической величины (М) и стандартной ошибки (±m). Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что основой для образования ин-тра- и интермолекулярных поперечных связей при консервации биоматериала ГА и ДЭЭ служат аминогруппы лизина и оксилизина и именно эти связи отвечают за структурную стабильность обработанной ткани. Установлено, что суммарное количество остатков лизина и гидроксилизина в ксеноаортальных створках, консервированных исследуемыми эпоксидными препаратами, в 2,0-2,5 раза меньше, чем в образцах, обработанных ГА (р<0,01).

Ранее проведенные исследования показали, что эпоксидные препараты, помимо лизина и гидроксилизина, взаимодействуют также с гистидином, тирозином и метионином [2, 6, 7]. Результаты аминокислотного анализа подтвердили эту характерную зависимость и в отношении новых препаратов - СМ1, СМ2 и СМ3 (табл. 1). Таким образом, применение эпоксидных смесей позволяет добиться очень высокой суммарной плотности поперечных связей в коллагене имплантата.

Внутри ряда исследуемых эпоксисоединений отмечены различия в сшивающей активности. Так, эпоксисмеси СМ1, СМ2 и СМ3, по сравнению с ДЭЗ (р<0,05), более активно реагировали с метионином, но менее активно с тирозином. В отношении оксилизина сшивающая активность также различалась - минимальное количество остатков этой аминокислоты отмечено при применении ДЭЗ и СМ2, несколько выше у СМ1 и почти в 2 раза выше при консервации СМ3 (р<0,01).

Установленное различие сшивающей активности эпоксидных препаратов обусловлено различием химических компонентов, входящих в каждый препарат, а также стереохимической конфигурацией реакционных групп компонентов по отношению к реакционным группам коллагеновой матрицы. Кроме того, в состав изучаемых эпоксидных смесей в различных соотношениях входили эпоксиды с различной длиной углеродной цепи, как с линейной, так и разветвленной структурой, что, в свою очередь, также влияет на их сшивающую активность. Суммарное количество остатков аминокислот при использовании эпоксидных консервантов в

2 раза ниже, чем при применении ГА, отмеченное различие среди исследуемых эпоксисмесей не имеет статистической достоверности (р>0,05).

При гистологическом исследовании установлено, что все образцы имели однотипное строение - деление на слои сохранено, коллагеновые волокна расположены компактно в фиброзной слое и более рыхло в спонгиозном, сохранена их характерная извитость. Эндотелиальный слой практически отсутствует, фиброциты единичные, мелкие, с вытянутыми нормохромными ядрами (рис. 2, а-г ). Следует отметить, что в образцах, обработанных изучаемыми смесями, структура биоматериала более компактна. На срезах створок, обработанных ДЭЗ, заметны участки с так называемым «стромальным отеком» (рис. 2, а ), при использовании СМ1 и СМ2 таких участков значительно меньше (рис. 2, б, в ). В образцах, консервированных СМ3, такие структуры полностью отсутствуют. При этом в фиброзном слое отмечено явление «полимеризации» - образование щелевидных пространств между сшитыми волокнами коллагена, причем максимальный эффект наблюдали у СМ3-консервированных образцов (рис. 2, г ) . Вероятно, это обусловлено наибольшим содержанием в составе соединения с разветвленной структурой, обеспечивающей более плотную сшивку коллагена.

Этот феномен согласуется с результатами физико-механических испытаний. Показатели прочности створок, обработанных СМ3, были выше, чем в других группах образцов (р<0,05) (рис. 3). Прочность образцов, консервированных ГА, ДЭЭ, СМ1 и СМ2, практически не различалась (р>0,05). Показатели эластичности всех групп эпоксиобработанных образцов превосходили эластичность ГА-консервированных (р<0,05), при этом между собой эти группы достоверно не различались (р>0,05) (рис. 4).

Низкая эластичность образцов, консервированных ГА, обусловлена, по-видимому, тем, что глутаровый альдегид формирует ригидные гидрофобные связи, которые существенно снижают пластические свойства биоматериала [11]. Напротив, эпоксидные связи обладают значительной гидрофильностью, формируя в биоматериале структуры, подобные гидрогелю [3, 12, 13]. Благодаря этому, эпоксиобработанный биоматериал сохраняет естественные пластические свойства, близкие к нативному биоматериалу, и приобретает высокую резистентность к кальцификации [1,2, 4, 12].

Полученные результаты свидетельствуют, что эпоксидные смеси СМ1, СМ2 и СМ3 придают биоматериалу высокую резистентность к кальцификации (табл. 2). Так, содержание кальция в створках, консервированных исследуемыми препаратами и имплантированных крысам на 60 суток, незначительно превышало уровень кальция в контрольных неимплантиро-ванных образцах. В образцах, обработанных ГА, по истечении 60 суток с момента имплантации количество кальция в 80 раз превышало его содержание в эпоксиобработанных образцах.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что эпоксидные пре параты СМ1, СМ2 и СМ3 при использовании их в качестве консерванта биоматериала обеспечивают высокую сшивающую активность, что в итоге определяет удовлетворительную структуру коллагена, улучшенные физико-механические характеристики и значительную устойчивость к кальцификации в эксперименте.

Однако для успешного функционирования биопротеза клапана сердца в организме реципиента, помимо структурной стабильности биоматериала, большое значение имеют его тромборезистентные свойства. Как было установлено ранее, консервация ДЭЗ придает биоматериалу высокие био- и гемосовместимые свойства [1, 2, 4]. Наличие свободных эпоксигрупп, не

Таблица 1

Относительное содержание аминокислот в створках ксенобиопротезов клапанов сердца, консервированных различными способами

Аминокислота	Натив	ГА	ДЭЭ	CM1	CM2	CM3
THR	24,1±0,8	23,9±0,4	22,6±1,3	23,6±0,2	23,2±1,4	25,6±1,0
SER	34,8±0,7	39,4±1,2	31,3±0,5	34,2±0,4	34,2±1,6	38,3±1,5
GLU	84,4±0,8	85,5±0,7	58,8±1,8	66,5±1,7	62,2±4,6	62,2±2,43
PRO	107,4±6,5	116,9±0,4	102,4±1,6	104,3±0,3	101,9±2,5	102,5±09
OH-PRO	71,4±2,5	89,9±1,5	88,2±1,8	79,6±2,3	78,3±5,8	79,8±2,7
GLY	319,1±2,1	287,8±13,1	380,8±3,5	370,2±7,8	360,5±3,7	359,6±3,1
ALA	101,2±6,4	105,8±0,7	93,2±0,2	90,8±0,5	92,8±2,5	95,1±1,6
VAL	34,5±1,7	35,9±0,9	27,0±1,3	27,1±1,5	35,7±1,4	31,7±0,3
MET	6,7±0,2	4,57±0,4	5,2±0,3	3,1±0,3	3,7±0,2	3,6±0,9
ILE	15,5±0,2	17,4±0,1	14,3±0,5	14,8±0,2	15,8±0,6	17,4±0,7
LEU	41,7±0,3	43,7±0,7	39,9±1,3	41,7±0,2	43,9±1,1	47,0±1,2
TYR	8,8±0,2	6,9±0,2	2,5±0,1	3,7±0,2	5,3±0,5	5,7±0,2
PHE	18,8±0,7	21,4±0,1	17,7±0,1	19,3±0,4	19,8±0,3	17,9±1,3
HIS	8,4±0,2	6,2±0,07	0,6±0,1	1,1±0,3	1,3±0,2	0,6±0,02
OH-LYS	9,5±0,2	1,7±0,03	0,4±0,04	0,9±0,3	0,4±0,04	1,2±0,2
LYS	33,5±1,2	3,8±0,2	2,3±0,5	2,2±0,2	1,9±0,2	1,8±0,1
ASP	60,6±0,9	50,4±0,4	56,2±0,7	58,9±1,1	52,6±1,3	54,6±1,7
ARG	47,8±0,7	48,4±0,2	39,8±0,7	44,5±0,6	40,7±0,9	44,8±0,8

Таблица 2

Содержание кальция в биоматериале, обработанного различными консервантами

Кальций, мкг/г сух. ткани	Консервант
	ГА	ДЭЭ	CM1	CM2	CM3
До имплантации	0,48±0,11	0,57±0,09	0,54±0,12	0,59±0,08	0,55±0,10
После имплантации	121,85±15,7	1,40±0,18	1,53±0,32	1,48±0,22	1,54±0,30

■ ГА ПДЭЭ ПСМ1 ЩСМ2 ЩСМЗ

Рис. 3 . Разрушающее напряжение (МРа).

Консервант

■ ГА ПДЭЭ ПСМ1 QCM2 ЩСМЗ

Рис. 4. Относительное удлинение (Е, %).

Консервант

■ ДЭЭ DCM1 ПСМ2 ЩСМЗ

Рис. 5. Количество иммобилизованного гепарина.

Рис. 2. Гистологический препарат ксеностворки, консервированной: а - ДЭЗ; б - СМ1; в - СМ2; г - СМ3. Окраска гематоксилином-эозином, увеличение х 100.

вступивших в реакцию с коллагеном в процессе консервации, предопределяет возможность дополнительной модификации биоматериала биологически активными веществами.

Для повышения антитромбогенных свойств биологических протезов широко используется гепарин. Молекулы гепарина содержат набор различных функциональных групп, способных участвовать в реакциях химических превращений, но при выборе метода иммобилизации необходимо учитывать различную степень ответственности этих групп за антикоагулянтную активность. Поскольку активность гепарина обеспечивают сульфо- и в меньшей степени карбоксильные группы, в процессе иммобилизации следует использовать гидроксильные и аминогруппы [1].

При оценке ковалентно иммобилизованного гепарина было установлено, что биоматериал, обработанный эпоксидными смесями, связывает гепарин более активно, чем консервированный индивидуальным ДЭЭ (рис. 5). Связывающая активность ткани после обработки препаратами СМ1, СМ2 и СМ3 в 1,5-1,6 раза превышает активность ДЭЭ-консервированной (р<0,01) и составляет 580-615 мкг гепарина на мг сухой ткани. Эти результаты еще раз подтверждают предположение о том, что смеси, содержащие в своем составе, помимо мономерного эпоксида, соединения с несколькими эпоксигруппами, способны обеспечить более эффективное связывание антикоагулянта.

ВЫВОДЫ

Исследуемые эпоксисмеси СМ1, СМ2 и СМ3 обладают высокой сшивающей активностью, обеспечивая удовлетворительные физико-механические свойства биоматериала и высокую резистентность к кальцификации. Всем образцам ксеностворок, обработанных эпоксидными препаратами, присущи общие свойства, связанные с химической структурой консервантов и образуемых ими поперечных связей в коллагене: в процесс сшивки вовлекаются лизин, оксилизин, гистидин, метионин и тирозин. Кроме того, важным преимуществом исследуемых эпоксисмесей в сравнении с индивидуальным ДЭЭ, является активное связывание гепарина, что должно позитивно сказаться на тромборез-ристентных свойствах биологических протезов.

Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые эпоксисмеси, также как и ДЭЭ, являются эффективными консервантами биологических протезов клапанов сердца. Весьма перспективно дальнейшее совершенствование способов консервации биологических протезов клапанов сердца на основе эпоксидных препаратов СМ1, См2 и СМ3.