Применение углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных почв

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• 1.    получить накопительную культуру сапротрофных бактерий;

• 2.    выделить наиболее активные штаммы;

• 3.    исследовать возможность роста выделенных штаммов микроорганизмов на синтетической среде с добавлением нефти, отработанного моторного масла и целлюлозы в качестве единственного источника углерода;

• 4.    определить какой субстрат могут использовать данные штаммы в качестве источника углерода.

Стерилизацию чашек Петри, пробирок и колб производили сухим жаром при температуре 180 °C в течение 60 мин; питательные среды, минеральные добавки — насыщенным паром под давлением 1 атм при 121 °C в течение 20—30 мин [5].

Перед каждым посевом лабораторное помещение проветривали, проводили влажную уборку, обеззараживали воздух в помещении при помощи ультрафиолетового бактерицидного облучателя. Рабочее место (лабораторный стол, ламинарный бокс) и все рабочие поверхности протирали спиртом [3; 4]. '

Для получения накопительной культуры сапротрофных бактерий были отобраны несколько проб из компостной ямы. Полученную суспензию инокулировали в питательную среду с добавлением МПА. Для получения чистой культуры из отдельной колонии использовали принцип Коха [1].

Культуральные свойства колоний определяли визуально, морфологию клеток и цитологию — путем светлопольного микроскопирования препаратов «раздавленная капля» и «фиксированный над пламенем горелки / окрашенный» (метод окрашивания по Граму) [2; 5].

Для проверки роста штаммов на различных субстратах в качестве единственного источника углерода использовали: нефть, моторное масло и целлюлозу. Нефть и масло вносились из расчета 5 % от общего объема среды. Контролем служили идентичные среды без внесения в них микроорганизмов [6].

Для учета численности микроорганизмов контрольные и опытные колбы помещали в шейкер Water bath shaker type 357 с амплитудой 2, скоростью c.p.m 140 при температуре 30 “С. В колбах отбирали пробы жидкости яа 1-е, 2-е, 3-и, 4-е, 7-е, 9-е, 11-е, 14-е сутки. Численность определяли путем подсчета клеток в камере Горяева-Тома.

Из семи чистых культур микроорганизмов, выделенных из компостной ямы, были отобраны два наиболее продуктивных штамма (№ 1 и № 2). Данные культуральных свойств колоний, морфологии клеток и цитологии представлены в табл. 1 и 2.

Изучена динамика численности сапротрофных бактерий, растущих на водном растворе с добавлением минеральных солей, при 5 % загрязнении среды нефтью, отработанным маслом и при внесении целлюлозы. На рис.1 представлена динамика численности штамма № 1, на рис. 2 — штамма № 2.

Максимальная удельная скорость роста первого штамма наблюдалась на субстрате с

-д~ отработанное масло

-о- целлюлоза

Время, сут

Рисунок /

Динамика численности штамма № / сапротрофных микроорганизмов на водном растворе с добавлением минеральных солей

Рисунок 2

Динамика численности штамма № 2 сапротрофных микроорганизмов на водном растворе с добавлением минеральных солей

добавлением нефти. Однако быстрый рост на 7-е сутки сменился резким уменьшением численности. Наиболее устойчивый. рост, о чем свидетельствует продолжительная фаза «плато», наблюдался на среде с целлюлозой в качестве единственного источника углерода. На среде с добавлением отработанного масла зафиксирован небольшой скачок численности на 3-и сутки, затем — стабильное уменьшение численности до нуля.

Исходя из полученных данных, можно сказать, что динамика первого штамма говорит о его способности использовать в качестве источника углерода все вышеперечисленные

Таблица 1

Свойства штамма № /

Признаки	Результаты
Описание колонии
Форма	Круглая
Размер, мм	3
Цвет	Белый
Край	Бахромчатый
Блеск	Матовый
Поверхность	Шероховатая
Профиль	Кратерообраз н ы й
Консистенция	Вязкая
Морфология клеток и цитология	-..-                                  Ш < ^ - гл» ^А>  ■              . j# : :А^У : АЛ ^ Е£яф£’^ £                               7 А' • 7- --Зв аЗ Ы '*74      . V -   ;,    ,/'            Г '■ • '■   "7' • - -^*44 "V; "    7           *        Ж»                ' •                               1я Л *        ' ^..^
Форма и расположение клеток	Укороченные палочки, одиночные, сцепленные по несколько
Подвижность	Малоподвижные с круговым вращательным движением
Наличие эндоспор	Есть, много
Окраска по Граму	Грам «-»
Физиолого-биохимические свойства Рост на среде с нефтью	С увеличением численности
Рост на среде с моторным маслом	С сокращением чиленности
Рост на среде с целлюлозой	С увеличением численности

субстраты или их отдельные компоненты (поскольку нефть и техническое масло — это многокомпонентные вещества). Наибольшим биотоксическим эффектом обладает отработанное масло, вероятно, из-за присутствия в его составе тяжелых металлов и различных присадок. Аналогичный вывод можно сделать на основании динамики роста на нефти.

Штамм № 2 показал сходные свойства на среде с добавлением отработанного масла (незначительный скачок численности и ее плавное уменьшение).

Способность использовать целлюлозу в качестве источника углерода на 2—2,5 по-

рядка выше, чем у предыдущего штамма и выше, чем способность утилизировать нефть.

В результате проделанной работы было выделено 7 сапротрофных штамма и получены их чистые культуры. Два наиболее активных штамма были подробно изучены; описаны культуральные свойства их колоний, морфология клеток и цитология. В будущем планируется провести дополнительные исследования с целью определения их систематической принадлежности.

На втором этапе работы были поставлены эксперименты, направленные на определение

Таблица 2

Свойства штамма № 2

Признаки Результаты Описание колонии Форма Круглая Размер, мм 1 Цвет Белый Край Гладкий Блеск Матовый Поверхность Шероховатая Профиль Кратерообразный Консистенция Зязкая Морфология клеток и цитология '                                        .                           it       ^                                                     . ‘     _’ ^ 1                     f         .                     ^® • с « .дми^а Форма и расположение клеток Длинные палочки, одиночные, сцепленные по несколько Подвижность Нет Наличие эндоспор Нет Окраска по Граму Грам «-» Физиолого-биохимические свойства Рост на среде с нефтью С увеличением численности Рост на среде с моторным маслом С сокращением численности Рост на среде с целлюлозой С увеличением численности круга субстратов, которые данные штаммы способны использовать в качестве единственного источника углерода и соответственно разлагать его (утилизировать). Данный опыт показал, что штамм № 1 обладает повышенной способностью разлагать нефть, а штамм №2 — целлюлозу. Отработанное масло для этих видов микроорганизмов ток сично и не отвечает условиям их нормального развития.

Данная работа в будущем может иметь практическое применение для создания коллекции штаммов, способных утилизировать органику различного состава, и применения их для биологической утилизации и переработки отходов.