Профиль устойчивости к антибиотикам Escherichia coli у детей с разным уровнем физической активности

O.P. Ikkert1’2, ,

V.A. Shepilova1’2, ,

L.S. Bandurova1, ,

M.A. Birt1, ,

A.V. Kabachkova1, ,

Введение. Устойчивость бактерий к антибиотикам представляет собой одну из самых серьезных проблем общественного здравоохранения в современном мире [1]. С увеличением частоты случаев резистентности эффективность применения различных классов антибиотиков снижается, что ставит под угрозу успешное лечение инфекционных заболеваний в целом. Большинство исследований, посвященных устойчивости кишечной палочки или Escherichia coli (далее - Е. coif) к антибиотикам. проводились на клинических образцах. так как именно Е. coli является одной из наиболее распространенных причин внут-рибольничных и внебольничных бактериальных инфекций [9. 10]. Но это ограничивает понимание динамики антибиотикорезистент-ности в более широком контексте. В то же время исследования, включающие здоровых людей, особенно детей, остаются малочисленными. Это создает пробел в знаниях о том. как факторы образа жизни, включая физическую активность, могут влиять на распространенность устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Наличие устойчивых штаммов Е. coli может изменять соотношение одних микроорганизмов к другим, что будет, безусловно, значимым для организма-хозяина. Доказано, что микробиота имеет сложные оси отношений с различными системами организма (как в норме, так и при патологии) [7]. Изменения в её составе [14. 22] могут способ- ствовать прогрессированию, а иногда и возникновению заболеваний. В настоящее время уже показана связь между состоянием микробиоты кишечника и неврологическими расстройствами [20]. ожирением [12. 19]. болезнью Альцгеймера [4], рассеянным склерозом [21]. болезнью Паркинсона [8] и шизофренией [17].

Понимание факторов, способствующих устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. особенно у детей, может стать ключом к разработке эффективных стратегий профилактики инфекционных заболеваний и способствовать улучшению здоровья населения. Физическая активность как важный аспект образа жизни может оказывать влияние на состав и функции кишечной микробиоты, способствуя её улучшению [15]. Наряду с этим регу.лярные физические нагрузки снижают уровень воспалительных процессов в организме [23]. Однако связь между уровнем фи-зической активности и распространенностью антибиотикорезистентности бактерий у детей ранее не изучалась.

Цель исследования: изучить профиль устойчивости к антибиотикам Е. coli у детей младшего школьного возраста с разным уровнем физической активности.

Материалы и методы. В исследовании приняли участие две группы условно здоровых детей, каждая из которых состояла из 12 волонтеров с равномерным распределением по полу и возрасту без симптомов острых вирусных и/или бактериальных заболеваний. Возраст детей варьировался от 8 до 10 лет. Первая группа состояла из детей, которые не занимались дополнительными физическими нагрузками, кроме обязательных занятий по физической культуре в школе. Вторая группа включала детей, которые дополнительно ре-гулярно посещали секцию боевых искусств (тхэквондо) более двух лет. Все дети на протяжении последних 6 месяцев не принимали антибиотики или препараты, влияющие непосредственно на микробиоту кишечника. Критериями исключения были острые аллергические реакции и отсутствие согласия родителей на участие детей в исследовании.

Образцы кала собирали однократно преимущественно в утренние часы и помещали в стерильные пластиковые контейнеры объемом 50 мл и хранили в холодильнике при температуре 2-4 °C на протяжении 2-4 ч до транспортировки в лабораторию. В лаборатории образцы кала разделяли на аликвоты в предварительно маркированные криопробирки объемом 2 мл и замораживали при температуре -80 °C для последующего анализа.

После завершения сбора всех образцов проводили микробиологические посевы на дифференциально-диагностическую среду Эндо для выделения штаммов Е. coli. Для этого 0.1 г фекалий растворяли в 100 мл стерильной воды, а затем 0.1 мл суспензии распределяли по всей поверхности чашки Петри со средой Эндо. Культивирование проводили в термостате при температуре 37 °C в течение 48 ч. Получен-ные колонии пересевали в отдельные чашки Петри со средой Эндо. Идентификацию Е. coli осуществляли на основе характерного колониального роста, микроскопирования и секвенирования гена 16S рРНК. Секвенирование гена 16SpPHK проводили для некоторых штаммов, колонии которых не имели классического металлического блеска на среде Эндо. ДНК из этих штаммов была выделена с помощью коммерческого набора HiPure Universal DNA Kit (Китай). Амплификацию проводили с использованием праймеров 27F и 1492R. Продукты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза на 1%-ном агарозном геле и отправляли в Научно-производственную компанию «СИНТОЛ» (г. Москва). Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности проводили с использованием пакета программ BLAST и базы данных GenBank.

Для оценки чувствительности выделенных штаммов Е. coli к антибиотикам использовался метод, при котором раствор антибиотика добавляли непосредственно в среду Эндо. В исследовании были испо.льзованы широко назначаемые антибиотики, в том числе в детском возрасте - амоксициллин [16]. цефазо-лин [11]. амикацин [24]. цефтриаксон [5] и тетрациклин [2]. Сравнительная характери-стика используемых лекарственных препаратов представлена в табл. 1.

Были испо.льзованы следующие концент-рацип антибиотиков в растворе: амоксициллин - 50 мкг/мл и 100 мкг/мл: цефазолин -20 мкг/мл; амикацин - 20 мкг/мл: цефтриаксон - 5 мкг/мл; тетрациклин - 5 мкг/мл. После добавления антибиотиков в среду проводили посев выделенных штаммов, а затем инкуби-ровали при 37 °C в течение 48 ч. Наличие или отсутствие колоний указывало на чувствительность шли устойчивость штаммов Е. coli к соответствующим антибиотикам.

Таблица 1

Table 1

Сравнительная характеристика антибиотиков

Comparative characteristics of antibiotics

Цефазолин Cefazolm	Цефтриаксон Ceftriaxone	Амоксициллин Amoxicillin	Амикацин Amikacin	Тетрациклин Tetracycline
Цефалоспорины (1-е поколение) Cephalosporins (1st generation)	Цефалоспорины (3-е поколение) Cephalosporins (3rd generation)	Пенициллины Penicillins	Аминогликозиды Ammoglycosides	Тетрациклины Tetracyclines
11нгибирует синтез клеточной стенки бактерий Inhibits bacterial cell wall synthesis			11нгибирует синтез белка в бактериях, связываясь с рибосомами Inhibits protein synthesis in bacteria by binding to ribosomes
Грам+ нек. Грам— Gram+ some Gram-	Широкий спектр (Грам+ и Грам-) Wide spectrum (Gram+&Gram-)	Грам+ нек. Грам-Gram+ some Gram-	Грам-Gram-	Широкий спектр (Грам+ и Грам-) Wide spectnun (Gram-&Gram-)
[11]	[5]	[В]	[24]	[2]

Примечание. Грамположительные бактерии или Грам+ имеют толстый слой пептидогликана и окрашиваются по Граму: грамотрицательные бактерии или Грам- имеют тонкий слой пептидогликана и не окрашиваются по Граму, а также более устойчивы к антибиотикам: нек. - некоторые.

Note. Gram-positive bacteria (Gram+) are characterized by a thick peptidoglycan layer in their cell walls, which allows the to retain the Gram stain: Gram-negative bacteria (Gram-) are characterized by a thin peptidoglycan layer, which prevents the retention of the Gram stain. Additionally. Gram-negative bacteria are generally more resistant to antibiotics.

Дополнительно была проведена оценка количества штаммов Е. coli. устойчивых к антибиотику амоксициллину. Для этого использовался метод предельных разведений: 1 г фекалий растворяли в 10 мл воды (1-е раз-ведение). затем из 1-го разведения брали 1 мл и растворяли в 10 мл воды (2-е разведение) и так далее. Каждое разведение высевали на среду Эндо с амоксициллином в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл. После инкубации проводили подсчет колоний.

Результаты исследования и их обсуждение. В ходе исследования были проанализированы образцы Е. coli. выделенные из микробиоты кишечника детей. В первой группе детей, не занимающихся дополнительными физическими нагрузками, было выделено 19 различных штаммов Е. coli из 12 проб (в семи пробах были обнаружены по два штамма, а в пяти пробах - по одному штамму). Во второй группе детей, занимающихся дополнительно тхэквондо, из 12 проб было выделено 13 штаммов Е. coli. При этом в одной из проб были обнаружены два штамма, а в остальных пробах - по одному штамму. При исследовании устойчивости выделенных штаммов к антибиотикам результаты показа-ли, что из 19 штаммов первой группы прояви-

ли устойчивость к амоксициллину 15. Кроме того, девять штаммов оказались устойчивыми к цефазолину и цефтриаксону, шесть штаммов - к амикацину, и лишь один штамм продемонстрировал устойчивость к тетрациклину (табл. 2).

Наблюдение о том. что два штамма из одной пробы устойчивы к одному и тому же антибиотику. является важным индикатором наличия у них схожих генов устойчивости. Это может быть результатом как горизонтального переноса генов, так и мутации, но в контексте данного исследования более вероятным объяснением является именно горизонтальный перенос, что подчеркивает важность мониторинга устойчивости к антибиотикам и понимания механизмов её распространения среди патогенных микроорганизмов.

Что касается второй группы, из 13 выделенных штаммов лишь шесть оказались устойчивыми к амоксициллину, из них два штамма проявили устойчивость к цефазолину. два штамма - к цефтриаксону, один штамм -к амикацину, и ни один из штаммов не показал устойчивости к тетрациклину (табл. 3).

Подсчет числа колониеобразующих единиц (далее - КОЕ) Е. coli. устойчивой к амоксициллину. в концентрации 100 мкг/мл в об-

Таблица 2

Таблица 3

Table 3

Устойчивость штаммов E. coli к антибиотикам у детей, занимающихся тхэквондо

Antibiotic resistance of Е. coli strains in children practicing taekwondo

разцах первой группы показал вариабельность от 1,3-10⁴ до 1.2-10⁶ КОЕ/г. Полученные данные свидетельствуют о том, что у детей, посещающих только обязательные занятия по физической культуре в школе, имеется повышенный риск формирования устойчивых к антибиотикам штаммов Е. coli. В долгосрочной перспективе это может негативно сказаться на состоянии здоровья таких детей. Во второй группе, состоящей из детей, регулярно

занимающихся тхэквондо, количество КОЕ было ниже на два порядка. Минимальное значение в этой группе составило 3-102 КОЕ/г. а максимальное - 2.6-104 КОЕ/г (табл. 4).

Важно отметить, что в шести образцах из данной группы антибиотикорезистентные штаммы не были обнаружены ни к одному из проверяемых антибиотиков. Эти результаты могут указывать на более низкую нагрузку на иммунную систему детей, занимающихся

Table 2

Устойчивость штаммов Е. coli к антибиотикам у детей, не занимающихся дополнительными физическими нагрузками Antibiotic resistance of Е. coli strains in children without additional physical activity

Проба Sample	Количество выделенных штаммов Number of strains isolated
	Всего Total	Цефазолин Cefazolin	Цефтриаксон Ceftriaxone	Амикацин Amikacin	Тетрациклин Tetracycline	Амоксициллин Amoxicillin
1	1	1		1		1
2	2		2	1	1	2
3	1		1	1		1
4	2	2				1
5	2		2			1
6	1	1				1
7	1			1		1
8	2	2	1			1
9	2	1		1		1
10	2		2			2
11	2	2				2
12	1		1	1		1
Всего Total	19	9	9	6	1	15

Таблица 4

Table 4

Концентрация колоний Е. coli, устойчивых к амоксициллину, в наблюдаемых группах, клх10⁴ КОЕ/г

Concentration of amoxicillin-resistant Е. coli in study participants, cells«104 CFU/g

Дети без дополнительной физической нагрузки (первая группа) Children without additional physical activity (first group)		Дети, регулярно занимающиеся тхэквондо (вторая группа) Children practicing taekwondo (second group)
Проба Sample	Среднее КОЕ E. coli Average CFU E. coli	Проба Sample	Среднее КОЕ E. coli Average CFU E. coli
1	26,7	13	2.50
2	102,7	14
3	2.4	15	0,04
4	25.0	16	2.67
5	20.0	17	1.70
6	2.6	18
7	1.0	19
8	50,7	20	0,03
9	64.0	21	1.30
10	107,0	22
11	124,7	23
12	1,3	24