Прогнозирование эмбриопродуктивности коров-доноров на основании эхографической характеристики яичников

Увеличение поголовья крупного рогатого скота (КРС) существенно ограничено малоплодием и длительной беременностью. При этом самки КРС обладают огромным генеративным потенциалом — сотнями тысяч яйцеклеток, и лишь незначительная их часть реализуется до конца хозяйственного пользования животного (1).

Трансплантация эмбрионов как биотехнология ускоренного воспроизводства открывает огромные возможности в реализации репродуктивнобиологического потенциала животных с заданными фенотипическими и генотипическими характеристиками и последующего максимального тиражирования их в стадах реципиентов с наименее ценными показателями (2-

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации — поддержка прикладных научных проектов по Соглашению ¹ 14.579.21.0147 о предоставлении субсидии, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI57917X0147.

• 6) . Несмотря на успехи в технологии трансплантации, актуальными остаются вопросы изыскания методов отбора доноров и реципиентов, индукции суперовуляции с более высоким выходом эмбрионов, снижения трудоемкости процесса и стрессового воздействия на животных (7-9).

Технология трансплантации эмбрионов включает много этапов (10). На первом необходим отбор коров-доноров (11) для последующей индукции полиовуляторной реакции яичников (12, 13). Обычно на этом этапе главное внимание уделяется племенной ценности и гинекологическому здоровью животного, но не прогнозированию индивидуальной реакции яичников на введенные гонадотропные препараты. В то же время именно от выбора доноров эмбрионов зависит эффективность следующих этапов и экономическая целесообразность процедуры трансплантации в целом (14).

Вариабельность реакции яичников коров на экзогенные гонадотропные препараты приводит к исключению примерно 30 % обработанных животных из группы доноров вследствие отсутствия полиовуляторного ответа на введенные гонадотропины (15). Именно высокая вариабельность делает полиовуляторный ответ яичников трудно предсказуемым (16, 17) и служит основным ограничением практического применения эмбриотрансплантации. При этом до сих пор нет достоверной информации о возможности прогнозировать эмбриопродуктивность у коров-доноров до введения гонадотропных препаратов, что существенно сказывается на экономической эффективности такой процедуры ускоренного воспроизводства КРС.

Анализ данных литературы свидетельствует, что на результативность реакции яичников коров — доноров эмбрионов экзогенные гонадотропины влияют многие факторы (18). Основными называют породные и физиологические особенности животных (19, 20), особенности метаболического (21) и гормонального статуса (22-25), генетическую предрасположенность (26-30), экологические и климатические условия содержания (31, 32). При всей множественности причин наиболее удобный объект для прогнозирования эмбриопродуктивности коров — яичники (33-35).

Ультразвуковую эхографию рассматривают как перспективный метод оценки морфофункционального состояния яичников при трансплантации эмбрионов (36). Такое обследование легко воспроизводить в производственных условиях, оно малоинвазивно и позволяет получить достаточно полную и объективную информацию в режиме реального времени.

Мы впервые использовали постпрессинговую морфометрию структур яичников для прогнозирования суперовуляторной реакции до введения гонадотропинов и на этой основе предложили экспресс-метод отбора коров для получения эмбрионов. Апробация метода показала его перспективность для оценки эмбриопродуктивности коров.

Целью исследования было сравнение данных эхографического обследования яичников, эмбриопродуктивности и эмбриосбора для разработки способа оценки ожидаемой суперовуляторной реакции и выявления перспективных доноров эмбрионов.

Методика . Исследование выполнено на поголовье коров породы казахская белоголовая (ООО «Племзавод Димитровский», Илекский р-н, Оренбургская обл.). В качестве доноров ( n = 30) отбирали клинически здоровых особей без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.) при наличии данных о происхождении не менее чем по трем рядам предков, с крепкой конституцией и оценкой экстерьера не менее 8 баллов, живой массой не ниже стандарта породы, в возрасте 3-6-го отелов, с подтвержденной достоверностью происхождения (по группам крови), с первыми проявлениями охоты в срок до 50 сут после отела, легким 754

отелом и неосложненным течением послеродового периода; индекс осеменения — 1,2-1,5, состояние матки и яичников нормальное (по результатам ректогенитального обследования методом эхографической визуализации в режиме реального времени и эндоректальной пальпации репродуктивных органов). Все коровы прошли обследование на инфекционные заболевания (бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.). По итогам животных разделили на три группы (по n = 10) в зависимости от длины желтого тела (I, II и III — соответственно от 2,5; 1,5-2,5 и менее 1,5 см).

Морфофункциональную оценку яичников коров проводили в динамике (с учетом данных постпрессинговой морфометрии яичников) — на 10-е сут полового цикла до введения фолликулостимулирующих препаратов, перед осеменением (эструс) при множественных созревших доминантных фолликулах и на 7-е сут индуцированного полового цикла с полиову-лятороной реакцией яичников и наличием множественных желтых тел на поверхности яичников (непосредственно перед извлечением эмбрионов).

Для эндоректальной эхографической визуализации яичников использовали УЗИ-сканеры Tringa Linear («ESA OTES p.A», Италия) и Kaixin KX5200 («Xuzhou Kaixin Electronic Instrument Co., Ltd», Китай) с линейными датчиками (рабочая частота — 7,5 МГц); фиксировали черно-белые эхографические изображения репродуктивных органов. При постпрессинговой морфометрии эхографические изображения обрабатывали с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США). Определяли длину, ширину и площадь яичников и желтых тел как параметры функциональной активности. Показатели рассчитывали с учетом длины прямого отрезка, ломаной линии, длины окружности неправильной формы, площади геометрической фигуры, угла проекции двух отрезков. Схематично отображали проекции структур на эхограмме. Площадь яичника и желтого тела определяли по формуле для эллипсоида: S = Rr, где R и r — соответственно большая и малая полуоси.

Половой цикл коров индуцировали Эстрофаном («Bioveta», Чехия) — препаратом простагландинового ряда F2a в дозе 2 мл/гол. (1-кратная внутримышечная инъекция), полиовуляторную реакцию яичников — препаратом ФСГ-супер (Россия) при 8-кратном введении с интервалом 12 ч (утро-вечер) в убывающих дозах (50 АЕ, 3; 3; 2,5; 2,5; 2; 2; 1,5; 1,5 мл/гол.).

Для искусственного осеменения использовали свежую сперму выдающихся быков-производителей, проверенных по качеству потомства и признанных улучшателями по таким признакам, как легкость отела и молочная продуктивность. Спермодозы соответствовали ГОСТ 26030-2015 (основные показатели: доля сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением — не менее 40 %, их число в одной дозе — 15 млн; объем дозы для осеменения — не менее 0,2 см³; жизнеспособность сперматозоидов при 38 ° С — не менее 5 ч). Подбор производителей и коров-доноров вели в соответствии с планом селекционно-племенной работы в хозяйстве.

Эмбрионы извлекали методом шприцевания (нагнетание жидкости в изолированную часть рога матки с помощью шприца, который подсоединен к 2-канальному катетеру, предварительно введенному в рог матки) на 7-е сут после осеменения. Использовали гибкие промывочные катетеры Neustadt Aisch/Rusch СН18 с четырьмя портами («Minitube», Германия). Для фильтрации промывочной жидкости и сбора эмбрионов применяли фильтры для КРС Em Guard («Minitube», Германия).

Для определения морфологического состояния эмбрионов их просматривали под микроскопом Биолам (АО «ЛОМО», Россия, увеличение

½60-100). Учитывали соответствие стадиям развития, форму зоны пеллюци-да и ее целостность, равномерность дробления бластомеров и общее состояние цитоплазмы.

При статистической обработке результатов рассчитывали средние ( M ) и их стандартные ошибки (±SEM). Данные обрабатывали с использованием пакета программы Microsoft Excel 2010 и Statistica 6 («StatSoft, Inc.», США). Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали по t -критерию Стьюдента, считая их статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты . Пример использования эхографических изображений при морфометрической оценке состояния яичников коров иллюстрирует рисунок 1.

Рис. 1. Пример обработки эхографического изображения яичника коровы — донора эмбрионов ¹ 12764 (казахская белоголовая порода) при оценке полиовуляторной реакции: а — исходное изображение; б — высота яичника, в — ширина яичника, г — окружность яичника, д — границы изображенных структур, выраженные ломаными линиями окружности неправильных форм, е — проекция изображенных структур на эхограмме (сагиттальная плоскость сканирования, б-е — обработка изображений в графическом редакторе ImageJ).

Для прогнозирования ответа яичников на введенные гонадотропные препараты оценивали эмбриопродуктивность коров-доноров с помощью анализа морфометрических показателей яичников и желтых тел с последующей постпрессинговой обработкой эхограмм репродуктивных органов коров, полученных на 10-е сут полового цикла. Измерение длины, ширины яичников и желтых тел позволило нам определить их площадь, соотношение размеров желтого тела и яичника.

Результаты морфометрии линейных размеров, площади яичников и желтых тел коров-доноров представлены в таблице 1.

• 1.    Морфометрические показатели яичников и желтого тела у коров — доноров эмбрионов на 10-е сут полового цикла без индукции полиовуляции ( M ±SEM, порода казахская белоголовая, ООО «Племзавод Димитровский», Оренбургская обл., 2017 год)

2. Соотношение площади яичников и желтых тел у коров — доноров эмбрионов на 10-е сут полового цикла без индукции полиовуляции ( M ±SEM, порода казахская белоголовая, ООО «Племзавод Димитровский», Оренбургская обл., 2017 год)

Среднее	Яичники			Желтое тело
по группе	длина, см	ширина, см	площадь, см2	длина, см	ширина, см	площадь, см2
I ( n = 10)	4,0±0,09	2,5±0,11	7,9±0,94	2,7±0,02	2,1±0,14	4,5±1,21
II ( n = 10)	3,2±0,04	2,3±0,34	5,7±0,78*	2,0±0,90	1,5±0,08	2,4±0,24*
III ( n = 10)	2,4±0,12	1,8±0,04	3,5±0,06**	1,4±0,08	1,0±0,00	1,1±0,25*

Прим еч ани е. I, II и III группы — животные с длиной желтого тела соответственно до 2,5; 1,5-2,5 и менее 1,5 см.

*, ** Различия площади яичников в группах II и III по сравнению с группой I статистически значимы соответственно при Р ≤ 0,05 и Р ≤ 0,001.

Наибольшую площадь яичников выявили в I группе, наименьшую — в III группе. Этот показатель у коров из I группы превышал таковой у особей из II (на 2,2 см2, Р ≤ 0,05) и из III группы (на 4,3 см2, Р ≤ 0,001).

Средняя площадь желтых тел тоже варьировала по группам. Так, в I группе показатель был выше аналогичного во II группе на 2,08 см² (Р ≤ 0,05), в III группе — на 3,43 см² (Р ≤ 0,05).

Среднее	Площадь, см2	Площадь желтого тела
по группе	яичника желтого тела	от площади яичника, %

I ( n = 10)    7,9±0,94     4,5±1,21

II ( n = 10)   5,7±0,78     2,4±0,24

III ( n = 10) 3,5±0,06     1,1±0,25

П р и м е ч а н и е. I, II и III группы

57,1±3,01**

42,1±2,95*

30,2±2,56

— животные с длиной

желтого тела соответственно до 2,5; 1,5-2,5 и менее 1,5 см.

*, ** Различия соотношений площади желтых тел и яичников в

I и II группах по сравнению с III группой статистически значимы соответственно при Р ≤ 0,01 и Р ≤ 0,001.

Мы сравнили соотношение площади желтых тел и яичников у каждого животного и в среднем по группам (табл. 2). Этот расчетный показатель, характеризующий размер функционально активного желтого тела перед индукцией полиовуляции, свидетельствовал о том, что величину яичников формирует размер лютеальной ткани. У животных с наименьшим размером желтого тела его лютеиновые структуры составили всего 30,2 % от размера яичников, что достоверно меньше соответствующих показателей у животных во II и III группах — соответственно на 12,0 (Р ≤ 0,01) и 27,0 см2 (Р ≤ 0,001).

В дальнейшем эхографическую визуализацию яичников проводили во время эструса перед осеменением (0-е сут полового цикла) и перед извлечением эмбрионов на 7-е сут после осеменения. Полученные эхограммы подвергали постпрессинговой обработке для определения динамики изменений, происходящих в яичниках в ответ на стимуляцию ФСГ и экзогенное введение лютеолитических препаратов простагландинового ряда F2a. При этом учитывали морфометрические показатели яичников, число и качественный состава фолликулов и желтых тел, отражающее полиову-ляторную реакцию яичников (рис. 2).

Рис. 2. Эхографическое отображение полиовуляторной реакции яичника у коровы — донора эмбрионов (казахская белоголовая порода) с длиной желтого тела 1,5-2,5 см: а — исходное изображение; б — высота яичника, в — ширина яичника, г — высота желтого тела, д — ширина желтого тела, е — окружность желтого тела (сагиттальная плоскость сканирования, обработка изображений в графическом редакторе ImageJ).

Результаты ректопальпаторного исследования яичников, а также данные, полученные при ультразвуковом сканировании и постпрессинго- вой обработке эхограмм, демонстрируют, что полиовуляторная реакция яичников и эффективность оплодотворения яйцеклеток зависят от каче- ства желтого тела в середине L-фазы (в период, предшествующий началу гонадотропной стимуляции коров-доноров) (табл. 3).

3. Стимуляция полиовуляции и эмбриопродуктивность у коров — доноров эмбрионов в зависимости от соотношения площади желтого тела и яичника ( M ±SEM, порода казахская белоголовая, ООО «Племзавод Димитровский», Оренбургская обл., 2017 год)

Среднее	Площадь желтого тела	Число
по группе	от площади яичника, %	желтых тел эмбрионов

I ( n = 10)            57,1±3,01           11,6±1,26     9,3±1,23

II ( n = 10)           42,1±2,95            5,7±1,24     4,6±1,01

III ( n = 10)          30,2±2,56            1,8±0,18     0,5±0,02

П р и м еч а ни е. I, II и III группы — животные с длиной желтого тела соответственно до 2,5; 1,5-2,5 и менее 1,5 см.

В I и II группах различия по числу желтых тел и полученных эмбрионов были почти 2-кратными, тогда как в III — оказались ниже практически на порядок (см. табл. 3).

При процессинге полученных данных мы использовали постпрессинговую обработку эхограмм для морфометрической оценки яичников и структур, вовлеченных в фолликулогенез и лютеогенез у коров-доноров. По сообщениям V. Kayacik с соавт. (36), постпрессинговая обработка эхографических изображений указывает на высокую эффектив- ность метода эхографии в морфометрических исследованиях.

Сопоставление данных о размере желтых тел перед индукцией полиовуляции и результатов, характеризующих эффективность проведенной суперовуляции и эмбриосбора, свидетельствуют о том, что у коров с соотношением площади желтого тела и площади яичника более 50 % удается индуцировать активную реакцию яичников с числом желтых тел в среднем 11,6±1,26, эмбрионов на одно извлечение — 9,3±1,23. Отметим, что, по данным ряда авторов (3, 8, 15, 34), средний выход эмбрионов на одно обработанное животное обычно составляет 5-6 шт.

Таким образом, ультразвуковой метод морфометрии яичников высокоинформативен, позволяет объективно оценить их функциональное состояние и прогнозировать эмбриопродуктивность у крупного рогатого скота. Обработка эхограмм в графическом редакторе ImageJ значительно повышает эффективность ультразвуковой визуализации. Показано, что реакция на стимуляцию фолликулостимулирующим гормонов и эмбриосбор зависят от размера желтого тела у потенциальных доноров на 10-е сут полового цикла (без индукции полиовуляции). Это можно использовать в качестве критерия при отборе животных в группу потенциальных доноров эмбрионов. Так, при соотношении площади желтого тела и яичника более 50 % число овулировавших фолликулов и качественных эмбрионов составляет 11,6±1,26 и 9,3±1,23 на особь.

Авторы благодарят специалистов хозяйства ООО «Племзавод Димитровский» (Илекский р-н, Оренбургская обл.) за помощь в выполнении исследований.