Прогнозирование риска развития протромбогенной готовности при инфекции COVID-19 с использованием генетического тестирования

многом зависит от особенностей самого вируса и исходного состояния системы гемостаза пациента [2]. Известно, что провоспалительные цитокины при инфекции COVID-19 стимулируют экспрессию тканевого тромбопластина на иммунных клетках и инициируют активацию свертывания крови. Дисфункция эндотелия, вызванная воспалением, дополнительно ускоряет протромботическую готовность, повышенную генерацию тромбина, угнетает активность фибринолиза за счет уменьшения активности активатора плазминогена урокиназного типа и повышения высвобождения ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-I) [3–7].

В настоящее время активно рассматриваются вопросы генетической предрасположенности к тяжелому течению коронавирусной инфекции. Так, ранее было показано, что изменения в гене ангио-тензинпревращающего фермента 2 (АПФ2), меняющие структуру данного рецептора могут облегчить или усложнить вирусу проникновение в клетку. Существуют отдельные данные, свидетельствующие, что дефицит функции белка ApoE при SARS-CoV-2 может способствовать прогрессированию заболевания и развитию ряда осложнений, обсуждается влияние генов гистосовместимости 1-го типа на течение ковид-инфекции [8–11].

При этом важно отметить, что роли наследственной тромбофилии высокого риска при инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, не уделяется должного внимания. Ранее было показано, что наследственно детерминированные тромбофилии высокого риска, такие как мутация фактора II (протромбина), фактора V Лейдена, а также аллельные варианты в гене PAI-1, могут не проявлять себя в течение всей жизни, но при таких триггерах, как травма, тяжелая инфекция, сепсис, беременность, могут манифестировать органными нарушениями, прогрессированием тромбинемии, тромбозами различной локализации, а в тяжелых случаях – развитием синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [7, 12, 13]. Следует отметить, что результаты молекулярно-генетического анализа для выявления протромбогенного полиморфизма в генах системы гемостаза могут влиять на интенсивность и длительность антитромботической терапии [7, 14–16].

В настоящее время используемые и доступные лабораторные тесты не позволяют объективно и достоверно прогнозировать риск развития и тяжесть состояния тромбинемии при инфекции COVID-19 на фоне генетической предрасположенности и, как следствие, выбрать соответствующий оптимальный режим антитромботической профилактики или терапии.

Цель исследования – анализ молекулярногенетических маркеров системы гемостаза у пациентов с новой коронавирусной инфекцией COVID-19

как прогностического триггера риска развития про-тромботической готовности.

Материалы и методы. Проспективное клинико-лабораторное исследование выполнено в период пандемии COVID-19 (апрель 2020 г. – май 2021 г.) на базе Регионального центра антитромботической терапии ГБУЗ АО «Первая городская клиническая больница им. Е.Е. Волосевич» (г. Архангельск) с включением 100 пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением новой коронавирусной инфекции.

Критериями включения в исследование явились: подтвержденная методом ПЦР-анализа инфекция COVID-19; госпитализация в ковидное отделение; письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании; возраст старше 18 лет. Критерии невключения: отказ от участия в исследовании; возраст младше 18 лет. Дизайн исследования был одобрен локальным этическим комитетом Северного государственного медицинского университета (протокол № 2/20 от 23.04.2020).

Лабораторные исследования выполнены на базе Регионального центра антитромботической терапии и бактериологической лаборатории ГБУЗ АО «Первая ГКБ им. Е.Е. Волосевич» (Архангельск). Отбор образцов плазмы осуществляли трижды: первая точка – при госпитализации пациента в стационар до назначения антитромботической терапии, вторая точка – на 3–5-е сутки госпитализации на фоне антитромботической терапии низкомолекулярными гепаринами (НМГ), третья – на 9–10-е сутки госпитализации на фоне антитромботической терапии НМГ.

Материалом для молекулярно-генетического анализа протромбогенного статуса явилась венозная кровь, полученная путем венепункции локтевой вены объемом 4,5 мл в вакуумный вакутейнер с ЭДТА (этилендиаминуксусная кислота). В качестве материала исследования использовался образец геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови. Для генотипирования полиморфизма и мутаций системы гемостаза использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом продукта.

Для анализа коагуляционных показателей (ва-кутейнер с цитратом натрия) полученные образцы крови центрифугировали при скорости 3000 об./мин в течение 15 мин. Исходя из временных методических рекомендаций версии 11, действующих на период проведения исследования, определяли протромбиновое время (ПВ), D-димер, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), фибриноген на автоматическом анализаторе Sysmex CS-2000i (Sysmex, Япония) в течение 30 мин с момента забора крови в вакутейнер ¹ .

Рис. 1. Класс тяжести течения коронавирусной инфекции по данным томографии легких

Дополнительно для оценки степени выраженности тромбинемии определяли показатели кинетики тромбина на автоматическом коагулометре Ceveron® alpha с TGA-модулем с использованием реагентов Ceveron TGA High (Technoclone GmbH, Австрия). Измерены и проанализированы время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak), эндогенный тромбиновый потенциал (AUC).

Статистический анализ выполнен с использованием программы SPSS Statistics, версия 20.0, и калькулятора MedCalc. Количественные переменные представлены как Me (median) и 25, 75-й процентили, качественные данные – в виде относительной частоты и 95%-ного доверительного интервала для доли. Сравнение количественных данных между зависимыми группами проводилось с помощью двухвыборочного критерия Вилкоксона. Критический уровень статистической значимости ( р ) принимался равным 0,05. Использованы методы корреляционного анализа (коэффициенты линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена), регрессионного анализа (множественная линейная регрессия и множественная логистическая регрессия).

Результаты и их обсуждение. Анализ тяжести течения новой коронавирусной инфекции показал, что медианный возраст пациентов, включенных в исследование, составил 63 [31; 85] года, из них женщин – 60 %, 4-й класс тяжести коронавирусной пневмонии наблюдался в 56 % случаев (рис. 1). У госпитализированных пациентов с внегоспиталь-ными пневмониями картина по данным СКТ соответствовала классификации КТ-4, госпитальные пневмонии развились у 1/3 пациентов, где также преобладали пациенты с КТ-4.

Как демонстрирует реальная клиническая практика, лабораторная диагностика протромботи-ческой готовности (тромбинемии) определяет решающую роль как в патогенезе, так и в интенсивной терапии инфекции COVID-19. В настоящее время лабораторными критериями ковид-ассоциированной коагулопатии и воспаления являются лабораторные маркеры, рекомендованные научными обществами [17, 18]. При этом следует учитывать, что рекомендуемые стандартные или рутинные гемостазиологи-ческие тесты, такие как протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень D-димера, фибриногена, не способны выявить состояние протромботической готовности при новой коронавирусной инфекции, а также спрогнозировать тяжесть протромботического состояния. Анализ динамики рутинных лабораторных показателей системы гемостаза у пациентов с COVID-19 представлен в табл. 1.

Было выявлено, что уровень D-димера статистически значимо повышался к четвертым суткам госпитализации, несмотря на проводимую анти-тромботическую терапию НМГ, уровни фибриногена и ферритина снижались только к десятым суткам терапии (рис. 2, 3). При этом важно отметить, что указанные лабораторные тесты относятся к лабораторным маркерам диагностики как состояния гиперкоагуляции, так и системного воспаления [19, 20], рутинные клотинговые тесты (АЧТВ, МНО) не показали диагностической значимости для выявления состояния тромбинемии.

Нами выдвигалась гипотеза, согласно которой клиническому проявлению тромбинемии у части пациентов с инфекцией COVID-19 может предшествовать наличие наследственного генетически детерминированного тромбофилического состояния, характеризующегося повышенным риском развития протромбогенной готовности на фоне носительства полиморфизма в генах фибриногена, протромбина и PAI-1, связанное с регуляцией кинетики (генерации) тромбина. В связи с этим мы посчитали возможным в группе пациентов с диагнозом новой коронавирусной инфекции провести молекулярно-генетическое исследование на предмет наличия генетического полиморфизма в системе гемостаза, указывающего на наследственно детерминированное тром-бофилическое состояние.

Таблица 1

Динамика рутинных показателей коагулограммы у пациентов с COVID-19 ( Me [ Q 1 – Q 3 ])

Показатель	Сутки госпитализации
	первые	четвертые	десятые
Тромбоциты, 109/л	246 [85–407]	287 [70–615]	319 [179–500]*
АЧТВ, с	34,7 [30–47]	36,8 [30–49]	34,2 [23–79]
Фибриноген, г/л	5,4 [2,3–6,8]	5,8 [3,2–6,5]	4,4 [2,8–7,2]**
D-димер, мг/мл	1,16 [0,2–7,0]	1,6 [0,3–5,5]*	1,2 [0,1–4,2]**
МНО, ед.	1,02 [0,8–1,0]	1,1 [0,9–1,1]	1,2 [1,0–1,2]

П р и м е ч а н и е : * р < 0,05 – различия статистически значимы по сравнению с первыми сутками; ** р < 0,05 – различия статистически значимы по сравнению с четвертыми сутками.

Рис. 2. Динамика показателей D-димера (мг/л), фибриногена (г/л) за время госпитализации: первые, четвертые, десятые сутки ( n = 100)

Рис. 3. Динамика показателей ферритина (нг/мл), СРБ (мг/л) за время госпитализации: первые, четвертые, десятые сутки ( n = 100)

Исходя из основной цели нашего исследования, был выполнен молекулярно-генетический анализ основных генов факторов системы гемостаза, детерминирующих коагуляционное звено (Factor V (rs6025), Factor II (rs1799963), Factor I (rs1800790), Factor VII (rs6046), Factor XIII A1 (rs5985)), тромбоцитарное звено (IGN A2 (rs1126643), IGN B3 (rs5918)) и активность фибринолиза (PAI-1 (rs1799889)), рекомендуемых для проведения персонифицированной фармакотерапии (табл. 2) [21]. Данные проведенного молекулярно-генетического тестирования показали, что самым распространенным генетическим полиморфизмом по всем исследуемым генам системы гемостаза в данной выборке пациентов явился «дикий тип», и только в гене PAI-1 (rs1799889) преобладал гетерозиготный полиморфизм – в 49 % и гомозиготный – в 34 % случаев (табл. 2).

Следующим этапом исследования явился анализ взаимосвязи генетического полиморфизма факторов системы гемостаза (FII 20210 G > A (rs1799963), FV 1691 G > A (rs6025), PAI-1 675 5G > 4G (rs1799889)) с тяжестью ковид-ассоциированной коагулопатии с использованием рекомендуемых рутинных тестов. Анализ показал статистически значимый рост уровня фибриногена к четвертым суткам (более 6,0 г/л; р < 0,001) на фоне носительства гетерозиготного аллельного варианта в генах PAI-1, фактора V и II. При этом уровень D-димера изменялся недостоверно с тенденцией к повышению у большинства пациентов независимо от генотипа исследуемых факторов системы гемостаза (табл. 3).

Согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) к наследственным тромбофилиям высокого риска относятся мутации в генах факторов II и V. В связи с этим нами проведен анализ наличия возможной взаимосвязи генетического полиморфизма в генах факторов протромбина FII 20210 G > A, V Лейден G > A с уровнем тромбинемии у пациентов с COVID-19. Анализ подтвердил, что уровень тромбинемии был выше у пациентов с наличием генетического полиморфизма в указанных генах (рис. 4).

Регрессионный анализ независимых предикторов тромбинемии и зависимой переменной D-димера при госпитализации (первые сутки) показал, что риск повышения уровня D-димера более 0,5 мг/л возрастал у пациентов с наличием генетического полиморфизма в генах PAI-1 (гетерозиготный аллельный вариант – β 95 % ДИ: 1,4 [0,6–2,13], p = 0,001; гомозиготный – β 95 % ДИ: 2,0 [0,3–1,5], p = 0,008) и гетерозиготного полиморфизма в гене фактора II (протромбин) (табл. 4).

По данным многофакторного анализа, на повышение уровня D-димера выше референсных значений достоверно влияло наличие генетического полиморфизма в гене PAI-1 и уровень ферритина выше 200 пг/мл (табл. 5).

Таблица 2

Распространенность генетических полиморфизмов генов системы гемостаза у пациентов с инфекцией

COVID-19, n = 100

Исследуемый ген	Генотип	Частота встречаемости, %	95 % ДИ
Factor XIII A1 (rs5985)	103 (G/G)	47,0	41,0; 53,8
	103 (G/T)	40,0	33,7; 46,0
	103 (T/T)	12,0	10,0; 15,4
IGN A2 (rs1126643)	807 (C/C)	43,0	45,0; 59,0
	807 (C/T)	38,0	31,5; 44,0
	807 (T/T)	19,0	17,0; 22,4
IGN B3 (rs5918)	1565 (Т/Т)	66,0	60,0; 73,0
	1565 (Т/С)	26,0	19,0; 31,0
	1565 (С/С)	12,0	10,0; 15,4
Factor V (rs6025)	1691 (G/G)	91,0	89,2; 92,8
	1691 (G/A)	6,0	4,2; 7,8
	1691 (A/A)	0	-
Factor II (rs1799963)	20210 (G/G)	93,0	90,6; 94,0
	20210 (G/A)	2,0	1,2; 4,4
	20210 (A/A)	0	-
PAI-1 (rs1799889)	–675 5G/5G	17,0	11,95; 22,51
	–675 4G/5G	49,0	42,2; 56,1
	675 4G/4G	34,0	30,8; 40,8
Factor I (rs1800790)	455 G/G	57,0	51,0; 63,8
	–455 G/A	37,0	30,7; 42,9
	–455 A/A	6,0	3,7; 9,4
Factor (VII rs6046)	10976 G/G	72,0	65,1; 78,2
	10976 G/A	23,0	17,0; 29,8
	10976 A/A	5,0	3,5; 7,9

Таблица 3

Уровень тромбинемии в зависимости от наличия аллельных вариантов в генах факторов II, V, PAI-1

Генетический полиморфизм	Сутки госпитализации
	первые	четвертые	десятые	первые	четвертые	десятые
	D-димер, мг/л ( Ме )			Фибриноген, г/л ( Ме )
PAI-I675 5G > 4G (rs1799889)
5G/5G ( n = 17)	0,9	1,5	3,2	4,9	4,6	4,0
4G/5G ( n = 49)	1,4	1,5	1,5	5,5	5,0	4,6
4G/4G ( n = 34)	0,9	0,9	0,7	5,3	5,7	4,1
FV 1691 G > A (rs6025)
GG ( n = 91)	1,3	1,8	1,2	5,4	5,0	4,5
GA ( n = 6)	0,7	0,5	1,1	5,9	6,7	3,7
FII 20210 G > A (rs1799963)
GG ( n = 93)	0,6	1,5	3,03	5,0	5,15	4,4
GA ( n = 2)	2,6	0,2	0,4	6,0	6,7	4,1

D-dimer_1 mgn

1 -норма 2-гетерозиготный полиморфизм

Рис. 4. Уровень D-димера и фибриногена при поступлении при наличии полиморфизма в гене FII 20210 G > A и в гене FV 1691 G > A

Таблица 4

Линейный регрессионный анализ (D-димер и генетический полиморфизм)

Независимый предиктор	D-димер
	β	р	95 % ДИ
FV (rs6025) дикий тип	1,2	0,1	-2,4; 2,27
– гетерозиготный полиморфизм	0,7	0,2	0,1; 1,1
– гомозиготный полиморфизм	1,0	0,3	0,31; 1,5
PAI-I (rs1799889) дикий тип	0,9	0,1	-0,43; 1,2
– гетерозиготный полиморфизм	1,4	0,001	0,61; 2,13
– гомозиготный полиморфизм	2,0	0,008	0,31; 1,5
FII (rs1799963) дикий тип	1,0	0,6
– гетерозиготный полиморфизм	0,3	0,01	0,3; 1,9

Таблица 5

Регрессионный анализ независимых предикторов тромбинемии и зависимой переменной D-димера при поступлении (первые сутки)

Предиктор тромбинемии	ОШ [95 % ДИ]	р
Наличие генетического полиморфизма в гене PAI-I (rs1799889)	1,2 [0,1 - 2,5]	0,005
Уровень ферритина более 200 пг/л	2,4 [1,1–5,4]	0,036
Уровень СРБ более 5,0 мг/л	0,1 [0,01-0,7]	0,999

Таблица 6

Показатели теста кинетики тромбина у пациентов с COVID-19 на момент включения в исследование до назначения антикоагулянтной терапии

Анализируемый показатель	Me [ Q1 ; Q3 ]	Референсный показатель
Время инициации свертывания (Tlag), мин	2,46 [1,3–4,2]	7,8–13,6
Эндогенный тромбиновый потенциал (AUC, nM), нМоль/мин	4425,1 [3400–5070]	1379,4–1735,9
Пиковое количество тромбина в образце (Peak), нМоль/мин	862,43 [680,4–1040]	98,4–153,7
Время достижения пика (tPeak), мин	5,87 [4,4–7,5]	16,7–23,2

Для объективизации лабораторной оценки состояния тромбинемии был использован тест генерации (кинетики) тромбина (ТГТ), который отражает количество генерируемого тромбина, кинетику его образования, и, таким образом, оценивается состояние протромбогенной готовности [22, 23]. Результаты анализа теста кинетики тромбина в нашем исследовании указывали на повышение прокоагулянтного потенциала крови у пациентов с COVID-19 уже при госпитализации в стационар. Так, было установлено, что у пациентов в первые сутки госпитализации статистически значимо изменялись все показатели кинетики тромбина, что свидетельствовало о значимой активации тромбина и состоянии тромбинемии – протромботической готовности (табл. 6).

Заключительным этапом данного исследования явился анализ взаимосвязи полиморфизма генов системы гемостаза с тестом кинетики тромбина как прогностического триггера риска развития протром-ботической готовности на фоне новой коронавирусной инфекции COVID-19. Корреляционный анализ времени инициации свертывания (Tlag) с генотипом фактора I (фибриноген) показал отрицательную умеренную взаимосвязь, то есть наличие гетерозиготного полиморфизма в гене фибриногена ассоциировано с уменьшением времени задержки свертывания. Наличие гетерозиготного и гомозиготного полиморфизма в гене фибриногена было ассоциировано с увеличением пиковой концентрации тромбина (Peak), которая была достоверно выше, в отличие от таковой у пациентов без данного генетического полиморфизма (рис. 5).

Наличие гетерозиготного и гомозиготного полиморфизма в гене PAI-1 было ассоциировано с уменьшением времени достижения пика тромбина (tPeak), то есть у пациентов с альтернативным полиморфизмом в гене PAI-1 пик тромбина достигался быстрее (рис. 6).

Корреляционный анализ уровня эндогенного потенциала тромбина (AUC) и генотипов генов факторов свертывания I, II и PAI-1 показал, что наличие альтернативного полиморфизма в гене фибриногена, PAI-1 было ассоциировано с повышением эндогенного потенциала тромбина (рис. 7).

Рис. 5. Корреляционный анализ времени инициации свертывания (tLag), пиковой концентрации тромбина (Peak thrombin, nmol/l) с генотипом фактора I свертывания (фибриноген)

Рис. 6. Корреляционный анализ времени достижения пика генерации тромбина (tPeak, мин) с наличием генетического полиморфизма в гене PAI-1: 1 – дикий тип; 2 – гетерозиготный аллельный вариант;

3 – гомозиготный аллельный вариант

Рис. 7. Корреляционный анализ уровня эндогенного потенциала тромбина (AUC) и генотипов генов PAI-1, факторов свертывания II и I: 1 – дикий тип; 2 – гетерозиготный аллельный вариант; 3 – гомозиготный аллельный вариант

Выводы. Таким образом, полиморфизм в генах PAI-1, протромбина (FII), фибриногена (FI) определял высокий уровень тромбинемии по показателям теста кинетики тромбина (эндогенного тромбинового потенциала (AUC), пиковой концентрации тромбина (Peak thrombin), времени достижения пика генерации тромбина (tPeak), уровня фибриногена и D-димера) у пациентов с COVID-19 в течение всего периода госпитализации. Полученные результаты свидетельствуют о генетической детерминации со- стояния протромботической готовности при наличии у пациентов с новой коронавирусной инфекцией аллельных вариантов в генах PAI-1, протромбина (фактора II) и фибриногена (фактора I). Продемонстрировано, что повышенная генерация тромбина, проявляющаяся повышенным уровнем эндогенного тромбинового потенциала (AUC), может являться прогностическим признаком протромботического состояния у пациентов с генетическим полиморфизмом в генах PAI-1 и фибриногена.

Проведенное пилотное исследование показало, что молекулярно-генетическое тестирование на наличие наследственно детерминированной тромбинемии может рассматриваться в качестве прогностического маркера риска развития состояния тромбинемии – протромботической готовности у пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением новой коронавирусной инфекции. Данные настоящего проспективного клинического исследования демонстрируют полезность предложенного молекулярно-генетического скрининга состояния тромбинемии при инфекции COVID-19. Врач-клиницист «красной» зоны ковид-ного госпиталя получает дополнительный объективный показатель, указывающий на возможность прогнозирования состояния тромбинемии на фоне острого воспаления при инфекции COVID-19.

Скрининг наличия генетического полиморфизма в медицине критических состояний необхо- дим при проведении патогенетически оправданной антитромботической терапии, а также в превентивных целях. Полученные результаты указывают на возможные молекулярные механизмы состояния тромбинемии при инфекции COVID-19 и свидетельствуют о целесообразности широкого внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику для оценки тяжести и прогнозирования протромбо-генного состояния.

По результатам проведенного исследования получен патент на изобретение № 2789822 от 10 февраля 2023 г.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания – Рег. № НИОКТР 121030300111-7.