Проявление сортовой специфичности в культуре апикальных меристем винограда, адаптированного на юге Красноярского края

Введение. Культура винограда – одна из древнейших и важнейших ветвей садоводства, которая активно развивается в условиях современной России. Благодаря появлению множества ранних ценных сортов с высокой морозоустойчивостью и постоянному совершенствованию укрывной технологии, культура винограда уже значительно продвинулась на север, в районы, где летнего тепла достаточно для вызревания раннеспелых сортов [1, 2]. В последние годы виноградарство становится все более популярной отраслью садоводства в Красноярском крае и привлекает внимание красноярских исследователей [3, 4].

Характерных для винограда вредителей в Сибири нет. Однако интродуцированные сорта могут быть заражены карантинными патогенами и вредителями [3]. Одной из наиболее перспективных технологий по оздоровлению посадочного материала является метод клонального микроразмножения на основе культуры апикальных меристем, позволяющий не просто получить оздоровленный посадочный материал, но и благодаря высокому коэффициенту размножения быстро его размножить в необходимом объеме [5, 6]. Регенерационный потенциал в культуре in vitro в значительной степени зависит от видовой и сортовой специфичности материнского растения [7–9]. Изучение сортовой специфичности в культуре апикальных меристем винограда может внести существенный вклад в микроклональное размножение данного вида.

Цель исследования: изучить сортовую специфичность в культуре апикальных меристем у четырех сортов винограда, адаптированных в условиях юга Красноярского края.

Задачи исследования: ввести апикальные меристемы в культуру in vitro и изучить показатели роста и развития эксплантов на разных этапах микроразмножения (приживаемость эксплантов; количество, длина и динамика роста побегов; количество и динамика формирования узлов на побеге; коэффициент размножения).

Объекты и методы исследования. Исследование было выполнено в лаборатории биотехнологии сельскохозяйственных и лесных культур (ЛБ СХиЛК) ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ, г. Красноярск, Красноярский край.

В качестве объектов исследования использовали сорта винограда столового назначения, адаптированные в условиях юга Красноярского края: Памяти Домбковской, Алешенькин, Юбилей Новочеркасска, Амирхан. Побеги винограда указанных сортов отбирали в частных садоводческих хозяйствах.

В качестве эксплантов при введении в культуру in vitro использовали апикальные меристемы, выделенные из пазушных почек винограда. Для этого побеги винограда разделяли на фрагменты с одной пазушной почкой, которые помещали в мыльный раствор на 30 мин и промывали под струей холодной проточной воды (30 мин). Материал обрабатывали 15 % раствором перекиси водорода в течение 15 мин, а затем промывали в трех сменах дистиллированной воды по 15 мин. Введение в культуру проходило в стерильных условиях ламинарного бокса. Под стереомикроскопом фрагменты апикальных меристем с одним-двумя листовыми примордиями вычленяли из почек и помещали на культуральные среды. Манипуляции проводили в чашках Петри на подложках из фильтровальной бумаги в растворе антиоксиданта (800 мг/л аскорбиновой кислоты).

Сформировавшиеся из апикальной меристемы стерильные побеги разделяли на микрочеренки и помещали на среду для микроразмножения.

Культивирование проходило на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), оптимизированной для клонального микроразмножения винограда в соответствии с рекомендациями Н.И. Медведевой [9]. Для введения апикальных меристем в культуру in vitro использовали среду M1 с пониженным содержанием макросолей и измененной концентрацией витаминов по сравнению с базовой MS: KNO3 1425 мг/л, NH4NO3 1237 мг/л, MgSO4×7H2O 277,5 мг/л, никотиновая кислота 4 мг/л, тиамин HCl – 10 мг/л, мезоинозит 100 мг/л, и в присутствии 1 мг/л цитокинина 6-БАП. На стадии микроразмножения использовали базовый состав среды MS с добавлением 2 мг/л 6-БАП. Культуры помещали в ростовую комнату с фотопериодом 16/8 и температурой 22–24 °C. Экспозиция на индукционной среде, а также время пассажа на этапе размножения составили 30 сут.

В ходе эксперимента учитывали приживаемость эксплантов, регулярно отслеживали показатели роста и развития эксплантов: количество, длину и динамику роста побегов; количество и динамику образования узлов на побеге. Коэффициент размножения рассчитывали по формуле

Кр=nIn , где n – количество микропобегов, шт; N – количество эксплантов, шт.

Статистический анализ проводили согласно принятым методам на базе ПК с использованием стандартного пакета анализа данных MS Excel 2007. Описательную статистику проводили по параметрам выборки: среднее, дисперсия, ошибка, доверительный интервал. Достоверность различий средних для показателей «количество узлов», «количество сформированных побегов», «скорость роста побегов», «длина побегов» и силу влияния фактора «сорт» определяли, используя однофакторный дисперсионный анализ.

Результаты исследования. Для инициации побегообразования было выделено и инокулировано на индукционную среду 112 апикальных меристем у четырех сортов винограда. Из них прижились, начали развиваться и в течение 4 недель сформировали побеги 27,7 % эксплантов. В 2,7 % случаях экспланты формировали по два побега (табл. 1).

Таблица 1

Результаты введения в культуру меристем винограда

Сорт	Эксплантов, шт.		Кол-во побегов, шт.	Отклик, %
	инокулировано	прижилось
Памяти Домбковской	9	4	4	44,4
Алешенькин	33	10	12	30,3
Юбилей Новочеркасска	27	8	9	29,6
Амирхан	43	9	9	20,9

Анализ биометрических характеристик на этапе инициации показал, что экспланты сорта Памяти Домбковской формировали наиболее длинные побеги (30,8 ± 1,75 мм), которые несли по 5–7 шт. узлов (рис. 1, в, г). У сорта Алешенькин длина побегов составила 9,3 ± 0,86 мм, а количество узлов – 2–3 шт/побег (рис. 1, а, б) Сорта Амирхан и Юбилей Новочеркасска показали близкие значения длины стерильных побегов (соответственно, 9,0 ± 0,45 и 6,8 ± 0,91 мм) и количества узлов – по 1–2 шт/побег.

Рис. 1. Инициированные микропобеги винограда, сорта: Алешенькин (а, б) и Памяти Домбковской (в, г); регенерация нормальных побегов микрочеренками, сорт Юбилей Новочеркасска (д); каллусообразование в основании эксплантов, сорт Амирхан (е)

Полученные на этапе инициации микропобеги разделяли на микрочеренки, которые затем инокулировали на среду для размножения. На изменившиеся условия культивирования неожиданно нетипично отреагировали экспланты сорта Амирхан, у которых побеги не формировались, а на 12 сут пассажа в основании микро- черенков было отмечено образование каллуса. Каллусогенез распространялся акропетально и центростремительно и к концу пассажа охватил большую часть микрочеренка (рис. 1, е). Экспланты остальных сортов формировали нормальные побеги (рис. 1, д).

На этапе микроразмножения исследуемые сорта формировали различное количество микропобегов. У сорта Памяти Домбковской на одном черенке из пазухи листа в 21 % случаев формировалось по два побега и более, у сортов Юбилей Новочеркасска и Алешенькин – в 33 и 56 % случаев соответственно.

Динамика образования узлов на побеге отличалась у разных сортов. Наибольшее количество узлов у сортов Памяти Домбковской и Юбилей Новочеркасска образовалось в первые 12 сут. В последующие дни и до завершения пассажа наблюдалось снижение скорости нарастания числа узлов на побегах соответствен- но на 38 и 58 %. У сорта Алешенькин скорость образования числа узлов была на 30–50 % ниже по сравнению с другими сортами и сохранялась на одном уровне в течение двух первых декад пассажа; затем скорость увеличилась на 34 % и сохранялась до конца пассажа. На 30-е сут культивирования побеги сорта Памяти Дом-бковской несли в среднем по 3,3 узла; сорта Алешенькин – по 2,7; сорта Юбилей Новочерка-ска – по 2,3 узла (рис. 2, А).

Коэффициент размножения на данном этапе в среднем на пассаж составил для сорта Алешенькин – 14,64; сорта Памяти Домбковской – 9,25; сорта Юбилей Новочеркасска – 8,58.

18 i

Алешенькин--Юбилей Новочеркасска

10       20

Сутки

--------1---------------1---------------1—

10      20      30

Сутки

-----Памяти Домбковской

Рис. 2. Динамика образования узлов на побеге (A) и роста побегов (Б)

По динамике роста на этапе собственно микроразмножения, как и на первом этапе, экспланты сорта Памяти Домбоковской сохранили лидирующее положение в сравнении с другими сортами (рис.2, Б). В первые 12 сут скорость роста побегов данного сорта составила в среднем 0,72 мм/сут. Далее динамика шла на понижение: в следующие 10 сут скорость роста снизилась на 32 % (0,49 мм/сут), и в последнюю декаду пассажа – еще на 43 % (0,28 мм/сут). Сорт Юбилей Новочеркасска также показал максимальную скорость роста побегов в первые 12 сут пассажа – 0,44 мм/сут, и в следующую декаду скорость роста снизилась почти в два раза – 0,24 мм/сут. Однако в последние 8 сут произошло некоторое увеличение темпа роста, и скорость возросла до 0,33 мм/сут. Динамика роста побегов у сорта Алешенькин заметно отличалась от остальных сортов и характеризова- лась устойчивым, примерно двукратным увеличением скорости роста каждые 10 дней до самого конца пассажа. Так, в первые 12 сут скорость роста побегов составила в среднем 0,2 мм/сут, в последующие 10 сут – 0,4 мм/сут, а в последние 8 сут – 0,7 мм/сут. В результате к концу пассажа сорт Алешенькин занимал промежуточное положение по интенсивности роста побегов, опережая на 15 % сорт Юбилей Новочеркасска и уступая на 24 % сорту Памяти Домбковской. Длина побегов составила: у сорта Памяти Дом-бковской – 15,8 ± 2,15 мм; у сорта Алешенькин – 12,06 ± 1,91; у сорта Юбилей Новочеркасска – 10,29 ± 1,75 мм (рис. 2, Б).

Однофакторный дисперсионный анализ показал, что в опыте исследуемые показатели у разных сортов значимо различались и что эти различия имели сортоспецифический характер (табл. 2).

Результаты однофакторного дисперсионного анализа

Таблица 2

Показатель	Сила влияния фактора «сорт», %	Уровень достоверности различий
Количество узлов	10,9	p < 0,05
Количество сформированных побегов	14,3	p < 0,05
Скорость роста побегов	8,9	p < 0,05
Длина побегов	24,8	p < 0,001

Выводы . Таким образом, в ходе настоящего исследования впервые введены в культуру in vitro сорта винограда, адаптированные в условиях юга Красноярского края. В культуре апикальных меристем получены стерильные побеги и затем размножены микрочеренкованием. Установлено, что реакция сортов на условия культивирования имеют сортоспецифический характер. Так, экспланты сорта Памяти Домбковской по скорости роста и длине побега, количеству вновь сформировавшихся узлов превосходили экспланты других сортов, участвовавших в эксперименте. Экспланты сорта Алешенькин выделялись стабильной положительной динамикой роста побегов и высоким коэффициентом размножения. Экспланты сорта Юбилей Новочеркасска занимали среднюю позицию по исследуемым показателям, а по характеру отклика были близки сорту Памяти Домбковской. У сорта Амирхан реакция на условия культивирования на этапе микроразмножения проявилась в виде каллусогенеза.

Полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований по клональному микроразмножению сортов винограда, адаптированных в условиях Красноярского края, что имеет несомненную ценность для развития виноградарства в Сибири.