Протективное влияние M-CSF на субпопуляционный состав моноцитов in vitro при ишемической болезни сердца

Ишемическая кардиомиопатия (ИКМП) является осложненной формой хронической ишемической болезни сердца (ИБС) и характеризуется поздней диагностикой и высокой летальностью [1, 2]. При этом ИКМП сопровождается необычным для ИБС субпопуляционным составом моноцитов крови: дефицитом неклассических форм без увеличения числа промежуточных моноцитов [3, 4]. В то же время для ИБС без кардиомиопатии характерен избыток промежуточных клеток при недостатке классических и нормальном уровне неклассических моноцитов в крови [3–5]. Подобные отличия свидетельствуют об особенностях патогенеза этих двух форм ИБС и вов- леченность в него моноцитарных клеток. Показано, что CD206+IL-4Rα+ макрофаги опосредуют неблагоприятный вариант ремоделирования миокарда при ИКМП [6].

В зависимости от экспрессии мембранных молекул CD14 и CD16 моноциты подразделяются на четыре субпопуляции [7]. Ключевой задачей классических моноцитов (CD14++CD16–) является поглощение патогенов и дериватов погибших клеток [4, 7]. Отличительной особенностью промежуточных форм (CD14++CD16+) является способность к интенсификации окислительного стресса и синтезу провоспалительных цитокинов; накопление их количества в кровотоке отмечается при остром коронарном синдроме [5]. Уникальное свойство неклассических моно- цитов (CD14+CD16++) заключается в протекции сосудов, очищении их интимы от апоптотических и некротических элементов, иммунных комплексов и модифицированных липопротеинов [7]. Переходные моноциты (CD14+CD16–) могут быть как предшественниками классических клеток (в норме), так и их производными (в случае дисфункции) [4]. Вероятно, модулирующим влиянием на субпопуляционный состав моноцитов обладает макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), который может быть использован в разработке клеточной терапии сосудистых заболеваний как один из компонентов «ци-токинового коктейля» для индукции эндотелиальных про-гениторных клеток (ЭПК) моноцитарного происхождения (CD14+CD34+VEGFR2+) in vitro. Известно, что M-CSF (синоним CSF-1) контролирует пролиферацию, созревание, жизнеспособность и функциональную активность клеток моноцитарного ряда [8, 9]. Однако его эффекты на субпопуляционный состав моноцитов при ИКМП не описаны, что создает опасность индукции не только ЭПК [10, 11], но и проатерогенных моноцитов.

Цель исследования: определить характер изменений общей численности моноцитов и их субпопуляционного состава in vitro в присутствии M-CSF у больных ИБС, страдающих и не страдающих ИКМП.

Материал и методы

В экспериментальное поперечное исследование «случай – контроль» in vitro был включен биоматериал 22 пациентов с ИБС, госпитализированных в НИИ кардиологии Томского НИМЦ (Томск, Россия), с целью определения тактики дальнейшего лечения. Были обследованы 19 мужчин и 3 женщины, возраст которых составил 62,0 [56,5; 64,0] года. У всех участников обнаруживался постинфарктный кардиосклероз, стенокардия напряжения II–IV функционального класса, хроническая сердечная недостаточность II–III функционального класса (по NYHA). По данным характеристикам больные ИБС, страдающие и не страдающие ИКМП, были сопоставимыми по возрасту (63,0 [57,0; 64,5] и 61,5 [55,0; 63,0] года, р = 0,628) и полу (соответственно мужчин – 90,9 против 81,8%, р = 0,512; женщин – 9,1 против 18,2%, р = 0,512).

Пациенты были распределены на две равные группы: 11 человек (10 мужчин и 1 женщина) с ИКМП и 11 пациентов (9 мужчин и 2 женщины) без признаков ИКМП. Критериями диагностики ИКМП служило наличие систолической дисфункции левого желудочка (фракция выброса менее 40%, конечно-систолический индекс более 60 мл/м2), инфаркта миокарда в анамнезе, стеноза левой коронарной артерии более 75%, либо выраженного поражения двух и более магистральных коронарных артерий (по критериям G.M. Felker и соавт., 2002 [12]). Из участия в исследовании исключались пациенты старше 70 лет, лица с острым воспалением или обострением хронического воспалительного процесса на момент исследования или за 3 нед. до него, с онкологическими или аутоиммунными заболеваниями, получавшие иммуносупрессивную терапию, а также пациенты, не подписавшие информированное согласие.

В качестве контроля были взяты клетки крови 10 условно здоровых доноров (7 мужчин и 3 женщин) в возрасте 56,5 [47,0; 66,5] года без патологии сердечно-сосудистой системы и жалоб соответствующего характера.

Жизнеспособность клеток регистрировали путем добавления 0,1% раствора трипанового синего (ООО НПО «ПанЭко», Россия). При показателе жизнеспособности ≥ 96% суспензию клеток в объеме 1 мл с концентрацией 1 × 10⁶/мл помещали в парные лунки 24-луночного планшета. Клетки культивировали 6 сут в атмосфере с 5% CO ₂ , в полной питательной среде, включающей RPMI-1640 (ООО НПО «ПанЭко», Россия), L-глутамин, эмбриональную телячью сыворотку (10% от общего объема) и антибиотик (пенициллин-стрептомицин в дозе 2500 мкг/ мл). В одну из лунок добавляли 50 нг рекомбинантного человеческого M-CSF (Cloud-Clone Corp., США) (стимулированная проба), вторая лунка стимулятор не содержала (контрольная проба). На третий день инкубации 60% культуральной среды заменяли на свежую с повторным внесением M-CSF (50 нг/лунку).

Через 6 дней культивирования клетки отделяли от дна лунки 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (ООО НПО «ПанЭко», Россия). После отмывки 0,5% раствором PBS полученную клеточную суспензию использовали для последующего анализа субпопуляционного состава моноцитов. Идентификацию их подтипов (CD14++CD16-, CD14++CD16+, CD14+CD16++, CD14+CD16-) проводили методом проточной цитофлуориметрии на приборе “CytoFLEX” (“Beckman Coulter International S.A.”, США) с применением моноклональных антител CD14-FITC и CD16-PE (“BD Biosciences”, США). Для исключения нежизнеспособных клеток применяли окрашивание ядер красителем DAPI (“Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.”, Китай). Долю моноцитов различных иммунофенотипов рассчитывали относительно общего количества всех моноцитов (CD14++/+ клеток), относительное содержание которых определяли среди жизнеспособных объектов, исключая область клеточного дебриса.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета программ STATISTICA 12.0. Количественные показатели описывали медианой и межквартильным промежутком ( Me [ Q1 ; Q3 ]). Сравнение количественных показателей в двух независимых группах проводили с помощью критерия Манна – Уитни, сравнение двух зависимых выборок – с помощью критерия Уилкоксона (при сравнении стимулированных и нести-мулированных проб в пределах одной группы обследованных). Корректировку на множественное сравнение осуществляли методом Бенджамини – Хохберга (в таблице представлены скорректированные с учетом поправки величины уровней статистической значимости). Для анализа взаимосвязей между показателями рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Порог статистической значимости принимали равным 0,05.

Результаты

Установлено, что в суспензии мононуклеаров, культивированных без добавления стимулятора, у больных ИБС (как с ИКМП, так и без нее) формировалась недостаточность промежуточных моноцитов по сравнению с их количеством у здоровых доноров, что у пациентов с ИКМП дополнительно сопровождалось дефицитом общего количества моноцитов (все CD14+ клетки) и тенденцией к снижению числа неклассических клеток (таблица).

В обеих когортах больных ИБС добавление M-CSF в культуру мононуклеаров приводило к приросту доли промежуточных моноцитов до значений здоровых доноров: при ИКМП он составил 93%, а при ее отсутствии – 63% (относительно доли этих клеток в нестимулированных пробах). Дополнительно пациенты с ИКМП характеризовались аккумуляцией CD14+/+ и неклассических клеток в культуре, стимулированной M-CSF (см. табл.). Доля классических и переходных форм в нативной культуре моноцитов не различалась между группами больных ИБС, соответствовала норме и не изменялась под действием M-CSF (см. табл.).

Корреляционный анализ выявил у здоровых доноров и пациентов с ИБС (в обеих группах – с ИКМП и без ИКМП) положительную связь между общим количеством моноцитов и долей их промежуточных форм при культивировании клеток без M-CSF и при его добавлении (рис. 1).

У пациентов с ИКМП в нативной культуре была установлена положительная зависимость общего числа моноцитов от трех субпопуляций одновременно: классических, промежуточных и переходных. После добавления M-CSF возникала дополнительная положительная связь между переходными и промежуточными клетками. При этом ассоциация между переходными и классическими моноцитами, напротив, исчезала (см. рис. 1).

У больных ИБС без признаков кардиомиопатии изначально наблюдалась положительная корреляция общего количества моноцитов с классическими и промежуточными формами. Однако при стимуляции M-CSF характер взаимосвязей изменялся: появлялась положительная корреляция также с переходными и неклассическими субпопуляциями. Кроме того, усиливались связи числа промежуточных моноцитов как с переходными, так и с неклассическими формами (см. рис. 1).

Проведенный корреляционный анализ зависимости содержания отдельных субпопуляций моноцитов от их общего количества в объединенной выборке пациентов с ИБС (включая как имеющих, так и не имеющих ИКМП) показал в образцах без стимулятора наличие статистически значимых положительных взаимосвязей со всеми иммунофенотипами моноцитов (рис. 2А, 2С). Под влиянием ростового фактора M-CSF эти связи становились еще более выраженными (рис. 2В, 2D), однако корреляция общего количества моноцитов с числом неклассических клеток практически не изменялась, оставаясь средней по силе ( rs = 0,50–0,69) как в нативной, так и стимулированной пробах.

Обсуждение

В ходе исследования выявлены особенности диф-ференцировочного потенциала моноцитов у больных ИБС при наличии и отсутствии ИКМП. Так, при ИКМП в контрольной пробе отмечалось уменьшение содержания общего количества моноцитов (в 4 раза) и промежуточ- ных моноцитов относительно показателей у здоровых доноров (см. табл.). Больные ИБС без кардиомиопатии отличались меньшим дефицитом промежуточных моноцитов при соответствующем норме общем количестве моноцитов (см. табл.). Учитывая равную у всех групп обследованных лиц чистоту культуры клеток до культивирования (около 85% по CD14++/+) и уменьшение доли CD14++/+ клеток после культивирования (до 40% даже у здоровых доноров) при высокой и равной в группах жизнеспособности клеток после культивирования 95–96%, можно предположить трансдифференцировку моноцитов в CD14– клетки [13]. Поскольку лишь для промежуточных форм установлен дефицит в нативной культуре у больных ИБС обеих групп, вероятно, именно они наиболее активно дифференцируются в немоноцитарные клетки. Согласно полученным результатам и корреляционному анализу, данный процесс в отсутствие стимуляторов присущ всем обследованным группам лиц (убыль CD14+ клеток и положительная корреляция CD14+ клеток с долей промежуточных моноцитов), но активнее происходит при ИБС (обнаруживается дополнительная связь с классическими формами) и еще более выражен при ИКМП (есть две дополнительные связи с классическими и переходными формами) (см. рис. 1).

Моноциты, обладая высокой пластичностью, могут осуществлять переход как между субпопуляциями, так и дифференцироваться в другие клетки: в макрофаги, характеризующиеся сниженной экспрессией CD14, и фибробласты / фиброциты, совершенно не экспрессирующие данный маркер [13]. Кроме того, моноциты с иммунофенотипом CD14+CD34+VEGFR2+ рассматриваются как ЭПК, составляющие около 1–6% от общего числа моноцитов в периферической крови [10, 11], и при наличии специфических «эндотелиальных» условий могут дифференцироваться в клетки эндотелиального типа [14, 15].

Повышенная способность моноцитов больных ИКМП трансдифференцироваться в CD14^– клетки in vitro может быть патогенетическим фактором развития ИКМП in vivo и объяснять склонность к фиброзированию миокарда [16] ввиду их перехода в фиброциты [17].

Промежуточные и неклассические субпопуляции моноцитов являются наиболее дифференцированными и активированными формами, их доля в крови возрастает при многих заболеваниях [10]. Вероятно, поэтому именно их численность максимально уменьшалась при культивировании у больных ИБС обеих групп (см. табл.). При этом выраженная тенденция к недостатку неклассических моноцитов в контрольной пробе у пациентов с ИКМП согласуется с данными об их дефиците в крови [3, 4].

По данным литературы, наиболее пластичной является классическая субпопуляция моноцитов [18]. При этом отсутствие различий в численности классических моноцитов у больных ИБС в культуре относительно нормы (см. табл.) не противоречит этому и может быть обусловлено тем, что при культивировании классические клетки дифференцируются сначала в промежуточные формы (такой переход происходит даже in vivo [17]), а затем последние, вероятно, трансдифференцируются в CD14– клетки.

В целом корреляционная матрица для культуры без стимулятора выявила особенности у обследованных лиц: у здоровых доноров общее количество моноцитов определялось только числом их активированных форм (промежуточными и неклассическими). У пациентов с ИБС без кардиомиопатии в трансформационные процессы

Таблица . Содержание моноцитов и их субпопуляций в культуре мононуклеаров, стимулированных и не стимулированных M-CSF, у больных ишемической болезнью сердца, страдающих и не страдающих ишемической кардиомиопатией, Me [ Q1 ; Q3 ]

Table . The content of monocytes and their subpopulations in the culture of mononuclear cells stimulated and non-stimulated with M-CSF in patients with coronary heart disease, suffering and not suffering from ICMP, Me [ Q1 ; Q3 ]

Содержание моноцитов, %	Группа обследуемых лиц
	ИБС без ИКМП		ИК М П		Здоровы е доноры
	Контроль	M-CSF	Контроль	M-CSF	Контроль	M-CSF
Все моноциты CD14++/+, %	17,79 [7,15; 35,63] р зд = 0,127	24,30 [4,93; 45,01] р зд = 0,310 р к = 0,477	10,63 [6,80; 17,64] р зд = 0,005 р ибс = 0,265	18,86 [8,72; 25,60] р зд = 0,109 р к = 0,033 р ибс = 1,000	40,42 [21,70; 47,62]	37,56 [15,69; 47,43] р к = 0,327
Классические моноциты CD14++CD16-, %	5,45 [2,13; 15,27] р зд = 0,428	7,84 [2,08; 18,64] р зд = 0,875 р к = 0,333	6,08 [1,76; 8,84] р зд = 0,228 р ибс = 1,000	4,90 [2,05; 15,63] р зд = 0,851 р к = 0,575 р ибс = 0,897	10,72 [6,73; 2,04]	10,22 [3,37; 1,186] р к = 0,249
Промежуточные моноциты CD14++CD16+, %	9,12 [5,23; 23,06] р зд = 0,042	14,90 [2,24; 19,8] р зд = 0,118 р к = 0,721	3,64 [2,03; 8,59] р зд = 0,003 р ибс = 0,100	7,02 [4,31; 11,73] р зд = 0,059 р к = 0,036 р ибс = 0,408	30,42 [13,36; 35,77]	24,61 [9,17; 36,37] р к = 0,249
Неклассические моноциты CD14+CD16++, %	0,86 [0,47; 1,28] р зд = 0,875	0,87 [0,30; 1,14] р зд = 1,000 р к = 0,508	0,19 [0,18; 1,11] р зд = 0,138 р ибс = 0,187	0,62 [0,31; 2,11] р зд = 0,572 р к = 0,028 р ибс = 1,000	0,92 [0,56; 1,27]	0,93 [0,68; 1,25] р к = 0,600
Переходные моноциты CD14+CD16-, %	2,90 [1,49; 4,47] р зд = 0,636	2,55 [1,70; 5,97] р зд = 0,263 р к = 0,333	2,48 [1,53; 4,80] р зд = 0,662 р ибс = 0,965	2,71 [2,42; 4,28] р зд = 0,345 р к = 0,889 р ибс = 1,000	2,53 [2,11; 4,78]	4,27 [2,64; 9,52] р к = 0,753

Примечание: ИБС – ишемическая болезнь сердца, ИКМП – ишемическая кардиомиопатия, M-CSF – колониестимулирующий фактор макрофагов, рк – уровень статистической значимости различий по сравнению с содержанием клеток в контрольной (нативной) пробе, рзд – в аналогичной пробе у здоровых доноров, рибс – в аналогичной пробе у больных ИБС без кардиомиопатии. Сумма относительного содержания всех четырех популяцией моноцитов в культуре может не совпадать со значением относительного содержания в графе «все моноциты» в той же группе пациентов примерно на 10% от данной цифры, так как в графах представлены не средние значения, а медианные, которые отражают наиболее часто встречающееся значение в выборке больных, и для разных субпопуляций клеток эти медианные значения не всегда принадлежат одному и тому же пациенту.

ИБС без кардиомиопатии

икмп

Здоровые доноры

Рис. 1. Корреляционный анализ содержания отдельных субпопуляций моноцитов с их суммарным количеством у больных ишемической болезнью сердца, страдающих и не страдающих ишемической кардиомиопатией, и у здоровых доноров

Примечание: Control – проба без стимулятора, M-CSF – проба с добавлением M-CSF (все корреляции положительные и статистически значимые, р < 0,05).

Fig. 1. Correlation analysis of the content of individual monocyte subpopulations with their total number in patients with coronary heart disease, with and without ICMP, and healthy donors

Note: Control is sample without stimulator, M-CSF is sample with the addition of M-CSF (all correlations are positive and statistically significant, p < 0.05).

Рис. 2. Взаимосвязь общего количества моноцитов в культуре с их отдельными субпопуляциями в контрольной пробе (А и С) и в присутствии M-CSF (B и D).

Примечание: Control – проба без стимулятора, M-CSF – проба с добавлением M-CSF, A – содержание классических и промежуточных моноцитов в контрольной пробе, В – содержание классических и промежуточных моноцитов в присутствии M-CSF, C – содержание неклассических и переходных моноцитов в контрольной пробе, D – содержание неклассических и переходных моноцитов в присутствии M-CSF.

Fig. 2. Relationship between the total number of monocytes in the culture and their individual subpopulations in the control sample (A and C) and in the presence of M-CSF (B and D)

Note: Control – sample without stimulator, M-CSF – sample with the addition of M-CSF, A – content of classical and intermediate monocytes in the control sample, B – content of classical and intermediate monocytes in the presence of M-CSF, C – content of non-classical and transitional monocytes in the control sample, D – content of non-classical and transitional monocytes in the presence of M-CSF.

вовлекались как активированные, так и неактивированные моноциты (включая промежуточные и классические подтипы). В то же время у больных ИКМП наблюдалось участие всех разновидностей моноцитов в процессах взаимных переходов, включая даже наиболее недифференцированные формы – классические и переходные (см. рис. 1). Следует заметить, что положительная связь любого параметра с CD14++/+ клетками логически идентична отрицательной связи с CD14– клетками, то есть уменьшение субпопуляций моноцитов в культуре сопряжено с приростом немоноцитарных клеток. Внесение M-CSF изменяет эти процессы.

Общая численность моноцитов и их субпопуляций в культуре при добавлении M-CSF у здоровых доноров не изменялась по сравнению с пробой без стимулятора (см. табл.), что, возможно, объясняется существованием в норме толерантности моноцитов к M-CSF в дозе 50 нг/ мл в условиях in vitro. Сигналы M-CSF внутрь клетки передаются через рецептор CSF-1R (CD115) [13]. При ИБС вне зависимости от наличия ИКМП дефицит промежуточных моноцитов под действием M-CSF нивелировался, что указывает на высокую чувствительность моноцитов к M-CSF на фоне ИБС, которая еще более усилена при наличии ИКМП (прирост неклассических моноцитов и CD14++/+ клеток в 3,3 и 1,8 раза соответственно, см. табл.). Это отражает большую способность M-CSF ингибировать спонтанную трансдифференцировку моноцитов именно при ИКМП.

Известно, что активации CSF-1R способствует интерлейкин (IL) 34, который служит его дополнительным лигандом [9]. Повышенная чувствительность моноцитов к M-CSF у пациентов с ИКМП может быть обусловлена сверхэкспрессией рецепторов CSF-1R, что описано в условиях избытка M-CSF [19]. Содержание M-CSF в крови у больных ИБС без кардиомиопатии понижено, но при ИКМП соответствует норме [4] и даже сочетается с накоплением IL-34 [20]. Очевидно, избыток IL-34 потенцирует чувствительность моноцитов к M-CSF, который посредством активации транскрипционного ядерного фактора NF-κB стимулирует экспрессию CSF-1R на CD14+ клетках у пациентов с ИКМП [20]. Поэтому исчезновение в условиях M-CSF уникальной для ИКМП положительной связи числа классических и переходных моноцитов в нативной культуре (рис. 1) можно объяснить M-CSF-зависимой экспрессией CD14 и / или активацией дифференцировки моноцитов из CD34+ предшественников. При этом для ИБС без кардиомиопатии уникальной является содружественная дифференцировка классических и промежуточных моноцитов, на которую M-CSF, напротив, не влияет (см. рис. 1).

Примечательно, что неклассические моноциты – самая малочисленная субпопуляция, однако эффект M-CSF на их дифференцировку при ИКМП оказался максимальным (прирост в 3,3 раза против контроля, см. табл.). В совокупности это означает, что M-CSF при ИКМП тормозит переход моноцитов в CD14– клетки (вероятно, в фиброциты), но не увеличивает долю провоспалитель-ных промежуточных моноцитов, стимулируя дифференцировку ангиопротективных форм в пределах нормы.

Заключение

Таким образом, вне зависимости от наличия кардиомиопатии ИБС характеризуется снижением доли промежуточных моноцитов in vitro , что у пациентов с ИКМП сочетается с убылью общего числа моноцитов вследствие их спонтанного перехода в CD14^– клетки. Добавление M-CSF предотвращает данный процесс без накопления проатерогенных клеток, а при ИКМП дополнительно увеличивает долю ангиопротективных неклассических форм и общее количество моноцитов, которые у больных ИКМП обладают, очевидно, повышенной чувствительностью к цитокину (ответ моноцитов на M-CSF в виде нормализации их общего количества и субпопуляционного состава выше, чем при ИБС без кардиомиопатии, а в норме ответная реакция совершенно отсутствует). Это демонстрирует применимость M-CSF для индукции in vitro моноцитарных ЭПК у пациентов с ИКМП без нарушений субпопуляционного состава моноцитов и риска усугубления атерогенеза.

Коллектив авторов благодарит научного сотрудника Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России канд. мед. наук К.В. Невскую за помощь в постановке культуральных методов исследования и подробные рекомендации по работе на проточном цитофлуориметре.