Протеолитическая активность алкалофильных микроорганизмов водных систем Забайкалья

Щелочные водные системы широко распространены в Забайкалье и представляют значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и практического использования. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих [1]. В этих условиях широко развиваются ал-калофильные и алкалотолерантные бактерии, представляющие интерес как продуценты внеклеточных ферментов. Среди ферментов, которые они синтезируют, важная роль принадлежит протеазам, принимающим активное участие в использовании микроорганизмами органических субстратов. Производство ферментов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объем продукции, которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без которых невозможно осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом [2].

Целью нашей работы было изучение внеклеточной протеолитической активности алкалофильных и алкалотолерантных культур, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья.

Объекты и методы исследования

В работе были использованы алкалофильные культуры 2а, 8а, 10а, Х4, С1К из коллекции ИОЭБ СО РАН, выделенные из содово-соленых озер Забайкалья.

Штаммы были исследованы на способность секретировать внеклеточные протеазы, активные на различных пара-нитроанилидных субстратах 4 групп сериновых протеиназ – трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных и цистеиновых (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA и glpFheAlapNA соответственно), методом Эрлангера и др. [3] и на белковом субстрате азоказеин для определения общей активности. Изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста этих культур (12-108 ч. культивирования) в зависимости от источника азота (неорганический азот – NaNO3, органический азот – казеин и пептон). Протеолитическую активность определяли спектрофотометрическим методом при 410 нм, активность по азоказеину при 440 нм.

Результаты и обсуждение

Определение общей активности по азоказеину . Штаммы были исследованы на способность секретировать внеклеточные протеазы для определения общей активности на азоказеине.

По результатам определения активности на азоказеине было отмечено, что культуры 2А, 8А, 10А, Х4 показали высокую активность на среде с минеральным источником азота (NaNO 3 ). Максимум активности (рис. 1) у культуры 2А (0,211 ед/мл) на 36 ч, 8А (0,41 ед/мл) на 96 ч, 10А (0,386 ед/мл) и Х4 (0,08 ед/мл) на 84 ч культивирования. Культура С1К показала высокое значение (0,479 ед/мл) на 108 ч культивирования на среде с пептоном.

Активность по азоказеину о т

Рис . 1. Изменение протеазной активности по азоказеину в процессе культивирования у культур 2а, 8а, 10а, С1К

Изучение внеклеточной протеолитической активности на синтетических субстратах и опреде ление молекулярной массы фермента . Данные показали, что из ряда культур: 2А, 8А, 10А, Х4 и С1К наибольшая активность обнаружена у культуры 2А и С1К. Остальные активности, присутствующие в среде, имели заметно более низкие значения. Показано, что культуры 2а, С1К обладают высокой протеолитической активностью по субстрату GlpAALpNA, активности по GlpFpNA, GlpFheAlapNA отсутствовали практически полностью. Пик активности по субстрату GlpAALpNA наблюдался на среде с неорганическим азотом (рис. 2) на 36 ч культивирования у культур 2а и С1К, на среде с казеином (рис. 3) высокую активность показала культура 2а (0,48 ед) через 24 ч культивирования, на среде с пептоном (рис. 4) культур а С1К показала максимум активности через 108 часо в и составила 1,38 ед.

Протеазная активность (NaNO3)

с 1 к

Время отбора , ч

Рис . 2. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с NaNO₃

2 а

Протеазная активность ( казеин )

2а с1к

Рис . 3. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с казеином

Рис . 4. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с пептоном

По результатам проведенных исследований можно заключить, что протеолитическая активность зависит от природы источника азота (органический, минеральный азот), концентрации азота и времени культивирования штаммов. Показано, что наибольшая активность протеаз обнаружена на минеральном источнике азота (3,209 ед/мл) при концентрации азота 1,5% на 3 сутки культивирования.

Полученные данные показали, что существенный вклад в протеолитическую активность культур 2а, С1К, по-видимому, вносят протеиназы с субтилизинподобной специфичностью, гидролизующие GlpAALpNA.

Использованный метод определения молекулярных масс – гель-фильтрация на Superdex G-75 показал, что молекулярная масса фермента 2а составляет 28000 Да, что характерно для субтилизинпо-добных ферментов.

Определение рН - оптимума и стабильности фермента . Определение рН-оптимума проводили в диапазоне рН 3,24 – 11,3. Исходя из полученных данных, показано, что протеазы активны в широком диапазоне значений рН. Наибольшая активность (рис. 5) проявляется в щелочной среде (рН 6,94 – 10,1), и стабильность (рис. 6) сохранялась в интервале рН 7,98 – 11,3.

рН - оптимум

рН

Рис . 5. рН-оптимум культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К

2а

8а

10а х4 с1к рН-стабильность

рН

Рис . 6. рН-стабильность культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К

Таким образом, секретируемые внеклеточные протеиназы алкалофильных бактерий относятся к субтилизинподобным протеазам, которые сохраняют свою активность при высоких значениях рН.

Определение температурной стабильности фермента . Температурную стабильность фермента (рис. 7) определяли в диапазоне температур от 23 до 80^оС, выдерживая реакционную смесь в течение 20 мин.

Термостабильность

—♦— 2А

—■— 8А

—С1К

Рис . 7. Температурная стабильность культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К

Все культуры сохраняют свою активность до 50оС, причем максимум активности наблюдается при 40оС, дальнейшее повышение температуры ведет к полной потере активности фермента.

Анализ природы функциональных групп активного центра . В работе использовались ингибиторы сериновых протеаз – фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), цистеиновых протеаз – йодацетамид (ЙАА), металлопротеаз – этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Активность исследуемых ферментов культур 2а, 8а, С1К ингибировалась ФМСФ – специфическим ингибитором сериновых протеаз. Данные ингибиторного анализа показали, что при добавлении ФМСФ до 1 мМ наблюдается практически полное ингибирование (у культур 2а, 8а, С1К – 27,3%, 34%, 52,5%, соответственно) внеклеточной протеолитической активности по отношению к субстрату GlpAALpNA.

Исходя из результатов ингибиторного анализа и субстратной специфичности, можно предположить, что секретируемые ферменты изученных культур относятся к классу сериновых протеаз субти-лизин-подобного типа.