Противолучевые свойства меланина

1Введение. Расширение сферы использования источников ионизирующего излучения в народном хозяйстве и медицине, периодически возникающие различного рода нештатные ситуации и инциденты на атомных энергетических установках, сопровождающиеся загрязнением окружающей среды, создают реальную опасность облучения значительных контингентов населения как в летальных, так и в относительно невысоких дозах.

Существующие противолучевые средства предназначены для применения непосредственно перед кратковременным облучением либо в течение первых суток после радиационного воздействия. Побочные реакции, парентеральный путь введения, снижение или отсутствие эффекта при облучении в диапазоне средних и малых доз делают их непригодными, в частности, для оказания медицинской помощи в случаях продолжительного пребывания лиц на территориях и производствах с повышенным радиоактивным фоном [1–3]. В таких условиях для массового использования наиболее перспективными являются средства, обладающие действием при приеме внутрь, широким спектром биологических свойств и низкой токсичностью. Это, как правило, фармакологические вещества, повышающие общую неспецифическую резистентность организма к воздействию различных экстремальных факторов, в частности к облучению. К таким биомедицинским средствам с полифункциональной активностью относится меланин — природный высокомолекулярный пигмент, который содержится в тканях микроорганизмов, растений, животных, человека, а также ряде пищевых продуктов (чай, кофе, гречиха и др.).

Меланин в настоящее время не является лекарственным средством и выпускается в виде пищевых добавок, производители которых рекомендуют его к использованию в том числе как препарат с радио-протекторной активностью. Однако к началу наших исследований экспериментально обоснованные данные, подтверждающие целесообразность перорального применения меланина для повышения радиорезистентности, практически отсутствовали. В единичных публикациях сообщается о повышении выживаемости мышей в результате профилактических инъекций меланина перед облучением [4, 5].

Цель: изучение влияния меланина при его курсовом приеме внутрь с питьевой водой на течение и исход лучевого поражения.

Материал и методы. Эксперименты выполнены на 270 аутбредных мышах CD-1, самцах и самках (SPF-категории), массой 21–27 г. Животные находились в условиях конвенционального вивария, содержались в стандартных клетках по 10 голов в каждой, имели свободный доступ к воде и получали полноценный брикетированный корм. Для опытов отбирались только клинически здоровые особи. Группы формировались случайным выбором из равнозначных по массе животных.

Меланин водорастворимый из производственных отходов гречихи предоставлен ООО «Опус» в форме пищевой добавки к пище «Фитоцен». Растворы меланина в дистиллированной воде в концентрации 12,5 мг на 100 мл мыши потребляли вместо воды после облучения, а в отдельных экспериментах до и после облучения.

Контрольные животные в аналогичных условиях для питья получали дистиллированную воду.

Испытания противолучевой активности меланина проведены при остром и фракционированном воздействии.

Однократное кратковременное одностороннее тотальное облучение осуществлялось на рентгеновской установке биологической РУСТ-М1 (РУБ РУСТ-М1): напряжение 200 кВ, ток пучка 2х2,5 mА, фильтр алюминиевый 1,5 мм. Мощность дозы в контейнере 0,85 Гр/мин ± 10%.

Часть мышей подвергалась также тотальному одностороннему воздействию гамма-лучей 60Со с мощностью 1 Гр/мин на установке РОКУС на базе ОИЯИ (г. Дубна).

Диапазоны доз облучения от 5 до 7,5 Гр. Фракционированное 10-кратное облучение на тех же установках проводили ежедневно по 0,5 Гр или 1 Гр в течение 5 дней, затем повторно в том же режиме с интервалом 2 дня. Суммарные дозы 5 Гр и 10 Гр.

Эффективность меланина оценивали по выживаемости в течение 30 сут, динамике гибели, средней продолжительности жизни (СПЖ) погибших мышей и изменениям кроветворения. Исследования проведены повторяющимися сериями, полученные результаты суммированы.

Оценку влияния на гемопоэз производили по показателям периферической крови, содержанию ми-елокариоцитов в костном мозге бедренной кости, массе тимуса и селезенки, а также количеству в ней эндогенных колоний. Для этих целей животных подвергали эвтаназии по 5–8 мышей из группы.

Показатели периферической крови определяли на гематологическом анализаторе Alcon 7 (ФРГ), число ядросодержащих клеток в костном мозге — по модифицированному методу Манца [6], массу органов — путем взвешивания на электронных весах Adventurer (Ohaus). Количество эндогенных колоний в селезенке, выявляемых после 2-часовой фиксации в жидкости Буена, подсчитывали на 8-е сут после облучения.

Анализ полученных результатов проведен с помощью общепринятых методов статистической обработки: критериев Стьюдента, χ2, Вилкоксона — Манна — Уитни и компьютерной программы «Биостат».

Эксперименты выполнены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», регламентированных приказом Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1987 г. № 755, включая гуманное отношение к ним.

Результаты. Однократное облучение рентгеновскими или гамма-лучами в дозах 6,5–7,5 Гр вызывало у мышей развитие поражений различной степени тяжести, характерных для костномозговой формы острой лучевой болезни (ОЛБ). В период разгара наблюдалось прогрессивное снижение массы тела, потребления жидкости и корма, угнетение двигательной активности, нарушения в системе кроветворения. Результаты проведенных исследований проиллюстрированы в табл. 1, на которой видно, что лечебное применение меланина с питьевой водой с 1-х по 30-е сут после облучения в дозах, соответствующих СД₈₀ и СД_>100, позволило увеличить число благоприятных исходов до 40 и 7% соответственно. В связи с близостью биологического эффекта при использовании гамма- и рентгеновского излучения, полученные результаты суммированы.

Таблица 1

Влияние применения меланина с питьевой водой (12,5 мг/100 мл) у мышей на исход острого радиационного поражения в смертельных дозах

Вид воздействия	Доза облучения, Гр	Группа	Кол-во мышей	Выживаемость		Средняя продолжительность жизни павших, сут
				абс	%
Рентгеновское облучение	6,5 (СД80)	Контроль Меланин	10 20	2 8	20 40	16,5±2,5 15,2±2,5
		Контроль	96	0	0	12,5±0,45
Рентгеновское и гамма- облучение	7,0–7,5 (СД100)	Меланин с 1-х по 30-е сут Меланин до + после облучения	70 50	5 8	7* 16**	12,7±0,5 14,3±0,2

П р и м еч а н и е : статистически значимые различия по сравнению с контролем по критерию χ2 (* — р<0,05; ** — р<0,01).

Заметное положительное действие на течение лучевого поражения отмечено также при комбинированном защитно-лечебном варианте использования меланина. Сочетание профилактического введения до облучения в абсолютно смертельной дозе с последующим продолжением приема на фоне развития ОЛБ способствовало увеличению выживаемости до 16% (p<0,01 по сравнению с контролем) и средней продолжительности жизни погибших (14,3±0,2 сут, в контроле 12,5±0,45 сут). Наилучший результат (40%) достигнут при 8-дневном приеме до и далее в течение 20 дней после воздействия радиацией.

Снижение дозы облучения до 6 Гр сопровождалось значительным ослаблением поражающего действия (СД~30/30): в контроле из 11 мышей выжило 8 (72%). Однако и в этих условиях лечебные свойства меланина при 30-суточном приеме внутрь проявились некоторым увеличением выживаемости: из десяти 9 (90%). Фактор изменения дозы (ФИД) составил 1,03.

Изучение кроветворения на 8-е сут после облучения в сублетальной дозе (5 Гр) показало, что масса тимуса (32,0±2,9 мг) и селезенки (38,9±5,3 мг) у леченых животных достоверно выше, чем у контрольных (соответственно 22,1±2,0 мг и 25,8±1,6 мг; р<0,05 и р<0,01). Количество эндогенных колоний в селезенке мышей, получавших меланин, практически в 2 раза превышало показатель в контроле: 6,3 (7,9÷5,1) и 3,3 (3,5÷3,2) (р<0,05).

Лечебный эффект меланина при фракционированном тотальном воздействии, следствием которого явилось развитие костномозговой формы ОЛБ, проиллюстрирован в табл. 2.

Таблица 2

Выживаемость мышей, получавших меланин в условиях 10-кратного фракционированного гамма-облучения (суммарная доза 10 Гр)

Группа	Кол-во мышей	Выживаемость
		Абс«	%
Контроль	16	7	43,7
Меланин	16	16	100*

П р и м еча н ие : меланин с 1-х сут от начала воздействия и далее до 30-х сут после его окончания; *– статистически значимое превышение показателя по сравнению с контролем (р<0,002).

Из представленных данных видно, что при тотальном 10-кратном облучении по 1 Гр применение меланина с 1-х сут позволило полностью предотвра- тить гибель мышей, тогда как в контрольной группе выживаемость составила 43,7% (р=0,002).

При меньшей дозе на фракцию 0,5 Гр и аналогичной схеме облучения (суммарно 5 Гр) смертельных исходов или каких-либо внешних проявлений изменения общего состояния и поведения в обеих экспериментальных группах отмечено не было. Исследование кроветворения показало, что у контрольных мышей уже на 7-е сут наблюдается заметное снижение (в 3 раза) количества лейкоцитов, миелокарио-цитов в костном мозге, массы селезенки и тимуса (в 2,7 и 1,4 раза соответственно) (табл. 3).

После повторного курса к 14-м сут сохранялась тенденция дальнейшего понижения уровня лейкоцитов и достоверное уменьшение общего числа тромбоцитов на фоне начавшегося восстановления кле-точности костного мозга и массы тимуса.

Применение меланина смягчало выраженность пострадиационных изменений. В период наибольшего угнетения кроветворения (7-е сут) у леченых мышей наблюдалось сохранение на более высоком уровне количества тромбоцитов в периферической крови (873±106 х 109/л; в контроле 715±46,6 х 109/л; р<0,02), миелокариоцитов в костном мозге (13,7±2,8 х 106; р<0,1) и ускорение восстановления показателей гемопоэза на 14-е и 21-е сут.

Обсуждение. Проведенные исследования свидетельствуют о наличии у меланина лечебного действия при курсовом приеме с водой после облучения. Это действие проявляется увеличением выживаемости мышей при костномозговой форме ОЛБ, вызванной кратковременным или фракционированным радиационным воздействием. При однократном облучении в диапазоне доз, соответствующих по летальности СД_80–100, величина достигнутого эффекта составила 40 и 7%. При 10-кратном фракционированном облучении в дозе 10 Гр число благоприятных исходов у леченых животных превысило показатель в контроле на 56%. Несмотря на относительно скромный результат при остром облучении, считаем важным подчеркнуть, что он достаточно стабилен и подтвержден воспроизводимостью при неоднократных повторениях экспериментов. Следует также принять во внимание и то обстоятельство, что лечебное действие меланина зарегистрировано при пероральном способе введения и дозах облучения, близких к абсолютно летальным. При подобных условиях назначения и уровнях лучевого воздействия большинство средств, повышающих радиорезистентность, к которым относится меланин, практически не эффективны [7–9].

Таблица 3

Группа	Время от начала облучения, сут	Показатели (M±m)
		Тромбо-циты, х 109/л	Лейкоциты, х 109/л	Кол-во ядросодержащих клеток в костном мозге, х 106	Селезёнка (масса), мг	Тимус (масса), мг
Меланин + облучение	7	873±10,6*	2,0±0,7	13,7±2,8**	50,3±1,8	31±4,2
Контроль облучения		715±46,6	1,6±0,19	8,1±1,17	48±2,12	29,5±3,36
Биоконтроль	0	862±43,7	6,1±0,45	30,1±2,7	134±11,2	42±4,3

П р и м еч а н и е : * — статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,02) и ** — различия значимы при р<0,1 (критерий Манна — Уитни).

Гематологические показатели (M±m) мышей, получавших меланин в условиях 10-кратного фракционированного рентгеновского облучения. (суммарная доза 5 Гр)

Важно отметить, что меланин не токсичен, не обладает радиосенсибилизирующими свойствами при длительном приеме до облучения и не снижает эффекта его последующего применения в процессе развития ОЛБ. Лечебные свойства меланина сохраняются при относительно невысоких дозах (6 Гр, СД~30), что подтверждается показателями выживаемости, а при несмертельных воздействиях (5 Гр) проявляется благоприятным действием на гематологический статус леченых животных и состояние центральных органов гемопоэза и иммунитета (тимус, селезенка). При малых дозах (1–1,25 Гр) позитивный эффект меланина ранее был продемонстрирован по показателям развития потомства крыс, подвергавшегося однократному и пролонгированному облучению в период эмбриогенеза [10–12]. Влияние меланина на кроветворение, по-видимому, связано с сохранением большего числа жизнеспособных клеток — предшественников, о чем свидетельствуют данные, полученные нами в методике эндогенного колоние-образования.

Перечисленные факты указывают на перспективность применения меланина при лучевой терапии онкологических больных. В реализации противолучевого действия меланина важную роль, вероятно, играет его выраженная антиоксидантная активность. Известно, что различные меланины ингибируют перекисное окисление липидов благодаря их способности перехватывать супероксидный радикал О2 и перекисные радикалы органических соединений [13– 16 и др.]. Показано также, что меланины усиливают иммунную защиту организма [10, 11, 17], обладают антимутагенным действием [18, 19], способствуют выработке цитокинов (интерлейкин-6, интерлейкин-8, туморнекротизирующий фактор и др.) — эндогенных регуляторов гемопоэза и иммунитета [17, 20–22].

Заключение. В ходе выполненных исследований обнаружены новые факты о противолучевых свойствах меланина, получены доказательства его эффективности при применении внутрь с питьевой водой после кратковременного и многократного фракционированного облучения в смертельных дозах. Низкая токсичность, простой способ введения, возможность его использования профилактически и после облучения расширяют доступность и условия применения меланина при различных ситуациях, связанных с воздействием ионизирующего излучения, включая лучевую терапию онкологических больных.