Противоопухолевое действие наночастиц металлов (экспериментальное исследование)

представляющие собой ультрадисперсные порошки металлов (Cu, Zn, Fe) и их сплава, синтезированные на Саратовском плазмохимическом комплексе ГНЦ ГНИИХТЭОС. Экспериментальное исследование проводили на моделях двух перевиваемых опухолей мышей: быстрорастущей асцитной саркоме 37 и медленнорастущей солидной саркоме 180. На обеих моделях изучали влияние введения НЧ металлов на регрессию опухоли; кроме того, на первой оценивали состояние опухолевых клеток, а на второй – выживаемость и продолжительность жизни опухоленосителей. В опытах использовали 40 белых беспородных мышей-самцов массой 18-20 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Для перевивки саркомы 37 20 мышам вводили внутрибрюшинно по 0,1 мл асцитической жидкости опухолено-сителя, разведенной в 0,2 мл среды 199, после чего опухоль росла в течение 4-х суток. Затем, когда происходило очевидное увеличение объема живота мышей, начинали ежедневное внутрибрюшинное введение взвеси НЧ металлов (Zn, Cu или Fe) в концентрации 10 мкг/мл по 0,5 мл. Контрольная группа мышей аналогичным образом получала по 0,5 мл физиологического раствора. НЧ вводили в течение 4-х дней, суммарная доза составляла 20 мкг/мышь. Затем введение прекращали и наблюдали животных еще в течение 4-х дней, чтобы оценить стойкость полученного эффекта. Таким образом, опухоль развивалась 12 дней, из них первые 4 дня и последние 4 дня НЧ мышам не вводили. Доза НЧ была выбрана исходя из средних доз современных металлосодержащих цитостатиков (препаратов платины), применяемых в клинической практике, и составила 1 мг/кг массы. На 13-е сутки у каждой мыши шприцом удаляли асцитическую жидкость (АЖ), измеряли ее объем. В пробах АЖ определяли количество опухолевых клеток путем подсчета в камере Горяева и процент погибших клеток, окрашивающихся трипановым синим; рассчитывали абсолютное количество живых опухолевых клеток на каждое животное по формуле:

N=VАЖ х n х %ЖК, где N - абсолютное количество живых опухолевых клеток на каждую мышь; V - объем АЖ; n - количество опухолевых клеток в 1 мл АЖ; ЖК – живые опухолевые клетки.

Солидный компонент опухоли, развивающийся в брюшной полости, измеряли, фиксировали формалином, окрашивали гематоксилином Карачи и изучали с помощью световой микроскопии. Саркому 180 перевивали 20 мышам под кожу спины, где она росла в течение 3-х недель до размера 20-40 мм3. Затем мышам начинали введение взвеси НЧ металлов в опухоль по 0,2 мл в концентрации 10 мкг/мл НЧ Zn, НЧ Cu и НЧ сплава (Zn+Cu+Fe), животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Введение НЧ осуществляли в течение 5 недель 1 раз в 3-4 дня, всего было выполнено 10 инъекций, суммарная доза НЧ составила 20 мкг на каждую мышь. Объем опухолей еженедельно измеряли и выражали в мм3. Кроме того, отмечали общее состояние и падеж животных. Срок наблюдения после начала введения НЧ составил 15 недель, в том числе, 10 недель после завершения введения НЧ. Статистическую обработку всех исследованных показателей проводили с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Уил-коксона-Манна-Уитни.

Результаты. Результаты изучения влияния введения НЧ металлов на рост саркомы 37 и количество ее клеток у мышей опытных и контрольной групп представлены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние введения НЧ металлов на рост саркомы 37 у мышей

Группы мышей	Объем		Количество опухолевых клеток
	АЖ (мл)	солидной опухоли (мм3)	n (106/мл АЖ)	N (106/ мышь)
Контроль	1,79±0,36	574±95	27,7±2,86	23,98±10,5
НЧ Zn	0,78±0,31*	154±88*	1,67±0,5*	0,636±0,2*
НЧ Cu	2,16±0,68**	374±90	8,13±1,54* **	11,1±3,53**
НЧ Fe	3,3±1,0**	322±112	8,26±2,37* **	17,7±5,7**

Примечание : * - статистически достоверные отличия от контроля; ** - статистически достоверные отличия от данных, полученных с НЧ Zn (Р<0,05)

Как видно из таблицы 1, у мышей всех групп с перевивной саркомой 37 в брюшной полости обнаружена АЖ, минимальный объем ее отмечен у животных, получавших НЧ Zn, а максимальный – у животных, получавших НЧ Fe. При этом статистически достоверные отличия от контрольной группы, демонстрируют только мыши, которым вводили НЧ Zn: у них объем АЖ был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе. У животных этой же опытной группы объем АЖ был меньше, чем у мышей, которым вводили НЧ других металлов (Cu и Fe).

Аналогичные различия установлены по количеству опухолевых клеток в АЖ мышей. Минимальное количество живых опухолевых клеток как на 1 мл АЖ, так и на каждую мышь определялось у животных, получавших НЧ Zn, а максимальное – у животных контрольной группы. Введение НЧ Zn приводит к статистически значимому снижению абсолютного количества живых клеток саркомы 37 не только по сравнению с контрольной группой (их уровень составлял всего 2,6% от контроля), но и по сравнению с мышами, которым вводили НЧ Cu и НЧ Fe. Количество живых опухолевых клеток у мышей, получавших НЧ Cu и НЧ Fe, рассчитанное на 1 мл АЖ, было статистически достоверно ниже, чем у контрольных животных. Однако в пересчете на каждую мышь указанные различия были статистически недостоверны из-за вариабельности индивидуальных данных. Показатели, характеризующие количество опухолевых клеток в АЖ мышей, которым вводили НЧ Cu и Fe, не имели статистически достоверных различий между собой.

Солидный компонент саркомы 37 был также наименьшим у мышей, получавших НЧ Zn (табл. 1). Результаты его гистологического исследования у опытных и контрольных животных представлены в таблице 2 и на рисунках 1-4. В опухолях мышей, получавших НЧ Zn, капсула была значительно толще, чем у контрольных. При действии НЧ Zn между очагами опухолевых клеток наблюдались обширные поля некроза (рис. 2А) и жировой дистрофии (рис. 2Б), тогда как у контрольных животных отмечались крупные очаги с плотным или разреженным расположением опухолевых клеток (рис. 1).

Рис.1 . Саркома 37 (контроль). Окраска гематоксилином. Ув. х400.

Б

Рис. 3. Саркома 37 (введение НЧ Cu).

Окраска гематоксилином. Ув.х400.

А –жировая дистрофия, Б – поле некроза

Б

Рис.2. Саркома 37 (введение НЧ Zn). Окраска

Рис. 4. Саркома 37 (действие НЧ Fe). Окраска гематоксилином. Ув. х400.

гематоксилином. Ув. х400.

А – поле некроза, Б – жировая дистрофия

Введение НЧ Cu приводило к сходным изменениям (рис. 3А, 3Б), а после введения НЧ Fe участки некроза были незначительными, а размер и характер очагов опухоли были близки к контрольным пробам (рис. 4).

Клетки саркомы 37 представлены двумя генерациями: крупными полигональными с оксифильной цитоплазмой и небольшими овальными с базофильной цитоплазмой, каждый из видов образует разные очаги. У животных, получавших НЧ Fe, преобладали клетки первой генерации, а у мышей, которым вводили НЧ Cu, – второй. Встречались гигантские клетки, количество которых в контроле составляло до 20 в поле зрения, при действии НЧ Fe до 17, НЧ Cu – до 10, НЧ Zn – до 8 в поле зрения. Количество опухолевых клеток, находящихся в состоянии митоза, также было минимально при действии НЧ Zn и составляло 1-2 в поле зрения, при действии НЧ Cu – 3-4, Fe – 6-7 в поле зрения, последнее значение было на уровне контроля. Количество дистрофически измененных опухолевых клеток при введении различных НЧ представлено в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительная характеристика дистрофических изменений в клетках саркомы 37 при введении НЧ различных металлов

Группы мышей	Дистрофически измененные клетки, %	Виды дистрофических изменений (%)
		Кариопик-ноз	Кариорексис	Кариолизис	Вакуолизация ядра и цитоплазмы
Контроль	13,74±2,3	22,53±1,18	29,41±1,79	29,41±1,79	17,65±1,52
НЧ Zn	71,69±8,74*	16,67±1,5*	29,17±2,02	50,0±6,11*	4,16±0,73*
НЧ Cu	48,2±5,58*	21,43±1,88	28,57±3,37	42,86±3,2*	7,14±1,05*
НЧ Fe	21,66±4,31	17,65±2,22	35,29±4,35	29,41±2,78	17,65±1,32

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05)

Как видно из таблицы 2, введение НЧ Zn и НЧ Cu вызывает резкое повышение процента дистрофически измененных опухолевых клеток саркомы 37; действие НЧ Zn является более выраженным. Среди отдельных видов дистрофии при действии НЧ Zn преобладает ка-риолизис, т.е., наиболее грубые повреждения клеток, при этом меньше, чем в других группах, таких изменений, как кариопикноз и вакуолизация. Таким образом, введение НЧ Zn способствует наибольшему повреждению опухолевых клеток асцитной саркомы. Далее по своему разрушительному действию следуют НЧ Cu, а у НЧ Fe такое действие минимально и статистически недостоверно. Итак, на модели саркомы 37 установлено, что максимальным повреждающим эффектом на асцитную опухоль обладают НЧ Zn, затем НЧ Cu, а наименьшим эффектом – НЧ Fe.

Результаты изучения динамики регрессии опухоли, выживаемости и продолжительности жизни мышей-опухоленосителей с саркомой 180, получавших НЧ металлов, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние введения НЧ металлов на динамику регрессии саркомы 180

Группы мышей	Показатели	Сроки наблюдения (недели после начала введения НЧ)
		0	1	2	3	4	5	6	7	8
и 5	V (мм3) М±m	38±1,76	50±18,7	78±29,7	131±37,8 **	191±83,6 **	283±128 **	297±56,1 **	298	-
	N	5/0	5/0	5/0	5/0	5/0	5/0	4/0	1/0	0
НЧ Zn	V (мм3) М±m	22±7,1*	11±6,4*	6,2±5,06 *	8	12,5	8	2	0	0
	N	5/0	5/0	5/0	5/2	5/3	5/4	5/4	5/5	5/5
НЧ Cu	V (мм3) М±m	29±8,4	15,6±7,1	7,8±3,96 ***	16±12,9*	14,5±8,2 *	3,75±2,2** *	6	0	0
	N	5/0	5/0	5/0	5/1	5/1	5/1	5/4	5/5	5/5
НЧ cпла ва	V (мм3) М±m	27±6,2	10,8±3,9 6* **	6,2±3,96 * **	3,5±1,4* **	0,73±0,4 2***	1	0	0	0
	N	5/0	5/0	5/0	5/1	5/2	5/4	5/5	5/5	5/5

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05); ** - статистически достоверные отличия от первоначального срока исследования (0); V - объем опухоли; N - число животных (число живых мышей/число мышей с полной регрессией опухоли)

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что у мышей контрольной группы опухоль растет в течение всего срока наблюдения (за 1 мес. ее объем увеличивается в 5,02 раз, а за 7 недель – в 7,8 раз). При этом у животных опытных групп отмечается ее выраженная регрессия (при введении НЧ Zn объем опухоли за 1 мес. уменьшается в 1,76 раза, НЧ Cu – в 1,8 раза, НЧ сплава НЧ – в 37 раз). Она регистрируется у всех мышей, получавших НЧ, уже через

1 неделю после их начала введения и последовательно продолжается вплоть до полного исчезновения опухоли, несмотря на то, что у разных животных даже в пределах одной группы происходит с неодинаковой скоростью. Первые случаи полной регрессии саркомы 180 обнаружены, начиная с 3-й недели наблюдения (табл. 3). Через 1,5 мес. наблюдения в контрольной группе на фоне роста опухоли начинается падеж мышей, а из животных опытных групп пальпируемые опухоли сохраняются только у 2-х мышей – у одной, получавшей НЧ Zn, и у одной, получавшей НЧ Cu. Все мыши, которым вводили НЧ сплава, к этому времени демонстрируют полную регрессию опухоли (табл. 3). К 8-й неделе наблюдения все контрольные мыши пали, а у всех мышей всех опытных групп регистрируется полная регрессия саркомы 180. Все они живы, активны, без видимых признаков интоксикации. Следует отметить, что введение НЧ закончено на 5-й неделе, а регрессия продолжается вплоть до 7й, т.е., по-видимому, имеет место кумулятивный эффект или последействие. К 15-й неделе ни у одной из опытных мышей не происходит рецидивирования опухоли; наблюдение продолжается.

Выводы: НЧ металлов проявляют противоопухолевое действие на двух экспериментальных моделях: перевивных мышиных саркомах 37 и 180. Введение взвеси НЧ непосредственно в опухоль вызывает гибель и дистрофические изменения опухолевых клеток, выраженное уменьшение объема асцитной опухоли, особенно демонстративное при действии

НЧ Zn, а также способствует увеличению выживаемости и продолжительности жизни жи-вотных-опухоленосителей, приводя к полной регрессии солидной опухоли. В отношении последней все использованные НЧ показывают сходную активность, однако, наибольшая отмечена у НЧ сплава металлов (Cu+Zn+Fe). Высокая эффективность, показанная в эксперименте, и отсутствие видимых признаков интоксикации при применении НЧ металлов позволяет говорить об их перспективности в качестве противоопухолевых препаратов.