Противоопухолевые свойства композиционного препарата фактора некроза опухоли альфа с производными гематопорфирина

К числу перспективных противоопухолевых препаратов относятся представители семейства факторов некроза опухоли, в частности фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), который является противоопухолевым агентом, подавляя рост злокачественных новообразований и вызывая геморрагический некроз опухолей [5, 15]. В то же время результаты клинических испытаний препаратов рекомбинантного ФНО-α человека свидетельствуют о широком спектре его побочных эффектов. Этот факт, а также незна- чительная величина терапевтического индекса ФНО-α являются основным препятствием для его широкого применения в медицине [8, 15, 18]. В связи с этим предпринимались многочисленные попытки снижения системной токсичности ФНО-α. В результате разработан ряд методических подходов к решению этой задачи, к ним можно отнести: создание мутантных форм ФНО-α; разработку его инкапсулированных форм; модификацию молекул ФНО-α путем конъюгирования с полимерами; использование

ФНО-α в комплексной терапии с цитокинами и другими модификаторами биологических реакций либо создание композиционных препаратов на основе этих биологически активных веществ, снижающих побочные эффекты и повышающих противоопухолевую активность ФНО-α [5, 7–11, 14, 16–19].

Среди соединений, которые можно было бы рассматривать как вещества-синергисты ФНО-α, следует выделить препарат производных гематопорфирина (ПГП), хорошо известный фотосенсибилизатор, используемый при проведении фотодинамической терапии онкологических заболеваний [4, 13]. Обращает на себя внимание сходство механизмов противоопухолевого действия ФНО-α и ПГП в сочетании с облучением. В обоих случаях основным патогенетическим фактором является цитотоксическое действие, нарушение кровоснабжения опухоли, приводящее к геморрагическому некрозу [1]. Учитывая это, можно было бы предположить, что препараты ФНО-α и ПГП в составе композиции способны усиливать эффект друг друга, результатом чего будет снижение эффективной дозы и, как следствие, выраженности токсических эффектов ФНО-α.

Целью исследования являлось изучение противоопухолевой активности композиционного препарата, содержащего в своем составе ФНО-α и фотосенсибилизатор ПГП, на экспериментальных моделях опухолей.

Материалы и методы

В экспериментах использовали препарат рекомбинантного ФНО-α человека, полученный по технологии, разработанной в ИМБТ, с удельной цитолитической активностью 3×107 Е/мг белка. Препарат производных гематопорфирина получали из гемина, выделенного из донорской крови человека. Диацетат гематопорфирина из гемина получали обработкой 50 % раствором бромистого водорода в уксусной кислоте. Полученный продукт обрабатывали раствором щелочи. Для освобождения от солей к раствору добавляли уксусную кислоту до рН 4,5; образовавшийся осадок тщательно промывали дистиллированной водой и нейтрализовали раствором щелочи. Полученный раствор ПГП замораживали и сушили в сублимационной сушилке. Все процедуры проводили в темноте для предотвращения фотоинактивации препарата. Композиционный препарат, содержащий ФНО-α и производные гематопорфирина (ПГП-ФНО-α), получали смешиванием равных весовых количеств ПГП и ФНО-α в фосфатносолевом буферном растворе при нейтральном значении рН.

Уровень токсичности композиционного препарата в сравнении с его компонентами определяли в экспериментах на половозрелых белых беспородных мышах-самцах ICR массой 20–22 г. Оценку противоопухолевой активности проводили на белых беспородных мышах-самцах ICR с массой тела 22–28 г и мышах-самках линии С57Bl/6 с массой тела 20–25 г. Животные получены из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Эксперименты поставлены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных МЗ РФ. Содержание животных осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Параметры летальных доз и максимально переносимую дозу препаратов рассчитывали экспресс-методом по В.Б. Прозоровскому [3].

В качестве экспериментальных моделей для изучения антионкогенного действия препаратов были использованы аденокарцинома Кребс-2, аденокарцинома Эрлиха и карцинома легких Льюис. Клетки опухолей перевивали подкожно в дозе 105 клеток на животное. Противоопухолевое и антиметастатическое действие препаратов оценивали, сравнивая массу первичного опухолевого узла, количество метастазов в легких животных опытных и контрольных групп; рассчитывали процент торможения опухолевого роста и ингибирования метастазирования.

Массу опухолевого узла мышей с аденокарциномой Кребса-2 и Эрлиха оценивали на 12-е сут после перевивки опухолевых клеток, c аденокарциномой легких Льюис – на 15-е сутки. Процент торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%) = (Вк-Во )/ Вкх100, где Вк– средний показатель массы опухоли в контрольной группе; Во– средний показатель опытной группы.

Подсчет числа метастазов в легких проводили на 19-е сут после перевивки карциномы легких Льюис. Индекс ингибирования метастазирования (ИИМ) вычисляли по формуле: ИИМ=[(АкхВк) – (АохВ о)]/ АкхВкх100, где Ак, Ао – частота метастазирования в конт, роле и опыте соответственно; Вк, Во – количество метастазов на 1 животное в контрольной и опытной группах.

Композиционный препарат ПГП-ФНО-α вводили подкожно, 3-кратно, с интервалом в 24 ч, начиная с 4–7-х сут после трансплантации опухолевых клеток. В качестве препаратов сравнения использовали ФНО-α и ПГП в эквивалентных дозах. Композиционный препарат ПГП-ФНО-α, содержащий 3–300 нг ФНО-α и 3–300 нг ПГП, вводили в диапазоне доз от 6 до 600 нг/20 г массы тела животных. Препарат ФНО-α вводили в дозах от 3 до 300 нг/20 г массы тела; препарат производных гематопорфиринов – в дозах от 3 нг до 300 нг/20 г массы тела. Контрольные животные получали инъекции растворителя (физиологического раствора).

Исследование уровня накопления композиционного препарата в ткани опухоли проводили на белых беспородных мышах ICR с трансплантированной опухолью Эрлиха. Препарат ПГП-ФНО-α вводили в дозе 3 мкг/20 г массы тела животных подкожно, в область опухолевого узла. В качестве групп сравнения использовали мышей, которым вводили ПГП в дозе, эквивалентной используемой в составе композиции. Через 0,5 и 3 ч после инъекции забирали на анализ кровь, образцы опухолевой ткани, бедренной мышцы, кожи, печени. Определение содержания производных гематопорфирина в ткани внутренних органов и сыворотке крови проводили по методу, описанному M.L. Pantilides et al. [17]. Органы гомогенизировали в буфере, содержащем 0,1М HEPES и 0,01М СTAB (pH = 7,0). Экстракцию гематопорфиринов проводили смесью этилацетат-ледяная уксусная кислота (4:1) с последующим гидролизом 1М раствором соляной кислоты и нагреванием до флуоресцирующих мономеров. Интенсивность флюоресценции измеряли при длине возбуждения/поглощения 404/494 нм. Калибровочные кривые строили для каждого органа, добавляя препарат ПГП в концентрациях

0,05–1,0 мкг к гомогенатам тканей органов либо крови, после чего полученные образцы проводили через те же стадии выделения и очистки, что и опытные образцы.

Данные экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ «Statgraphics, Version 5.0» (Statistical Graphics Corp., USA). Достоверность обнаруженных различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исследование токсических свойств препаратов показало, что ПГП-ФНО-α отличался более низким уровнем токсичности по сравнению с ФНО-α. Уровень среднесмертельной дозы композиционного препарата в 2,5 раза превышал его значения, полученные для ФНО-α. Значение LD50 для препарата ПГП-ФНО-α было равно 28,2 мг/кг, максимально переносимая доза – 20 мг/кг веса тела, тогда как для ФНО-α эти показатели составляли 11,2 и 6,0 мг/кг соответственно.

Сравнительная оценка чувствительности трех штаммов опухолей к воздействию ФНО-α показала, что наиболее выраженным эффект препарата был в отношении клеток аденокарциномы Кребс-2 (таблица). Процент торможения роста опухоли при введении ФНО-α в дозах 30 и 300 нг/20 г массы тела составлял 63,3 % и 73,3 % соответственно. Эффект препарата на мышах с подкожно трансплантированной аденокарциномой Эрлиха при использовании тех же доз был выражен слабее – 22,2 % и 59,7% соответственно. Клетки карциномы легких Льюис оказались наименее чувствительными к воздействию ФНО-α в использованных дозах. Процент торможения роста опухоли при введении препарата в дозе 3 нг не превышал 23,0 %, причем не обнаружено усиления эффекта препарата при увеличении его дозы. Введение ФНО-α в состав композиции не приводило к изменению селективности его воздействия на разные штаммы опухолевых клеток.

Результаты исследования композиционного препарата ПГП-ФНО-α, в сравнении с препаратом ФНО-α, на мышах с трансплантированной аденокарциномой Кребса представлены на рис. 1. Введение ФНО-α в

Таблица

Чувствительность разных штаммов опухолевых клеток к антибластоидному действию ФНО-α