Провирусная ДНК ВЛКРС в патогенезе лейкоза коров

Кeywords: bovine leukemia, polymerase immune сomplexes

Одним из основных факторов, сдерживающих эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе, является недостаточная изученность особенностей патогенеза инфекционного процесса. Несмотря на использование разноплано- chain reaction, immunosorbent assay, provirus, вых методов и технологий в диагностических исследованиях, основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляют серологические методы, которые основаны на обнаружении в сыворотке крови животных специфических антител к анти- генам ВЛКРС. Специфические антитела появляются в крови животного через 2-8 недель после заражения ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно. Кроме того, известно, что при хронических инфекциях, вызванных ретровирусами, в биологических жидкостях организма появляются иммунные комплексы (ЦИК). Не является исключением и лейкоз крупного рогатого скота. Согласно данным Yakob-son et al. (1998), иммунные комплексы в сыворотке крови инфицированных ВЛКРС коров содержат иммуноглобулины G, M и вирусные компоненты [7]. В исследованиях по выяснению структуры ЦИК нами доказано, что иммунные комплексы при лейкозе крупного рогатого скота могут содержать провирусную ДНК вируса [1]. Этот факт может иметь определенное значение в патогенезе инфекционной болезни. Во первых, иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекционность [2]. Во вторых, в процессе развития инфекционного процесса соотношение между свободными и связанными антителами в сыворотке крови постоянно меняется. Поэтому разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота могут быть недостаточно эффективными [8].

В настоящее время, наряду с серологическими методами исследования, в диагностике лейкоза крупного рогатого скота регламентировано применение полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве индикатора инфицированности животных в проведении противолейкозных мероприятий рекомендуют также использовать определение уровня провирусной нагрузки (PLV) [6]. Провирус большинства ретровирусов считается инфекционной единицей, а относительное количество интегрированного провируса в геноме хозяина, известное как провирусная нагрузка (PVL), связано с увеличением риска распространения инфекции [4, 5].

Учитывая, что диагностические мероприятия при лейкозе крупного рогатого скота по исследованию проб молока являются экономически более выгодными, це- лью настоящей работы являлось определение зависимости появления ЦИК в пробах молока, содержащих провирусную ДНК, от стадий развития инфекционного процесса.

Материал и методы исследований. Создали опытную группу животных из 12 коров, инфицированных в естественных условиях, из числа диагностированных, впервые по результатам РИД исследований и подтвержденные методами ИФА и ПЦР. Через каждые 2 месяца проводили исследования проб крови и молока на обнаружение ЦИК, провирусной ДНК и гематологических изменений. Иммуно-ферментный анализ проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак» по общепринятой методике и с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах. Результаты исследований по РИД получены в Республиканской ветеринарной лаборатории. ПЦР ставили с использованием реактивов тест-системы «Лейкоз КРС-провирус» на обнаружение провирусной ДНК в лейкоцитах и ЦИК молока. Циркулирующие иммунные комплексы выделяли методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ). При этом, пробы сыворотки крови смешивали в соотношении 1:1 с 7 % раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4 ^оС в течение 72 часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5, 7 и 10,5 % в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Подсчет лейкоцитов проводили в счетной камере с сеткой Горяева. Статус животного по лейкозу определяли исходя из количества лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови животного согласно «лейкозному ключу».

Результаты исследований. В экспериментальной группе животных наблюдения велись в течение года. Через каждые 2 месяца брали пробы крови и молока. Определяли количество лейкоцитов в

1 мкл крови, титры циркулирующих иммунных комплексов в молоке и наличие провирусной ДНК в ЦИК. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Все коровы экспериментальной группы с одного стада, возраст 2-4 года, все были диагностированы как инфицированные ВЛКРС впервые, т.е. с момента их заражения прошло не более 6 месяцев. Как видно по результатам исследований, представленных в таблице, после первого и второго исследований количество лейкоцитов в крови у всех подопытных животных в пределах физиологической нормы. Следовательно, гематологически больных животных нет. Следует отметить, что в пробах молока у всех животных, кроме № 5 после первого исследования обнару- живаются ЦИК-содержащие противолей-козные антитела в титрах от 1:2 до 1:16, которые в дальнейшем не исчезали практически у всех животных в течение всего эксперимента. Исключение составляет лишь корова № 2, у которой в исследованиях в третий раз (через 6 месяцев) в пробе ЦИК не обнаружены.

Провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются впервые у двух коров под № 3, 7 в исследованиях во второй раз, т.е. через 4 месяца после начала эксперимента. Важно отметить, что гематологические показатели у этих животных на данный момент в пределах физиологической нормы. В пределах нормы продолжает оставаться этот показатель у коровы № 7 и после третьего раза исследований.

Таблица 1 – Результаты исследований проб крови и молока инфицированных ВЛКРС коров.

После третьего раза исследований или через 6 месяцев с начала эксперимента провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются еще у одной пробы – № 12. При этом также гематологические показатели в пределах нормы - 9900 лейкоцитов в 1 мкл крови. Как известно, согласно «лейкозному ключу», у гематологически больных лейкозом коров, в возрасте 2-4 года, содержание лейкоцитов в 1 мкл крови свыше 11 тыс.

После четвертого раза исследований провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются всего у 6 проб. У троих из них, № 4, 5, 9, они обнаружены впервые. Только у коровы № 9 параллельно с обнаружением провирусной ДНК в ЦИК молока проявились и характерные для лейкоза гематологические изменения. Содержание лейкоцитов более 12 тыс. на 1 мкл крови.

Согласно правилам по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, животные, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД или ИФА, признаются инфицированными вирусом лейкоза, и подлежат исследованию через каждые 6 месяцев гематологическим методом на лейкоз. Животных с изменениями крови, характерными для лейкоза, признают больными, изолируют и сдают на убой. По существующим нормативно-правовым актам инфицированный ВЛКРС крупный рогатый скот может использоваться в хозяйственных нуждах с соблюдением ветеринарно-санитарных правил. Однако, обнаружение в крови и молоке ЦИК-содержащих провирусную ДНК, ставит под сомнение существующие методики о сроках возможной эксплуатации животных и о признании их больными лейкозом. Тем более способность ДНК сохранять жизнеспособность даже после длительной термической обработки считается доказанной [3].

Заключение. Роль циркулирующих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции недостаточно изучена. ЦИК, содержащие провирусную ДНК, возможно, формируются в процессе гибели инфицированных В-лимфоцитов путем соединения не встроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными IgM, обладающими высокой аффинностью к ДНК. Очевиден тот факт, что появляются они в молоке на более поздних стадиях болезни, при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада. Гематологические изменения в этот период в большинстве случаев остаются стабильными. Использование образцов молока для проведения молекулярно-генетических анализов по выявлению ВЛКРС в ЦИК является достаточно перспективным направлением для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и весьма информативным при определении статуса животного, а также возможностей и сроков эксплуатации инфицированного животного в производственных условиях. Результаты исследований дают основание пересмотреть критерии «инфицированного» и «больного» лейкозом животного.

Резюме

В статье описываются результаты исследований динамики изменений титров циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в молоке, обнаружения в них провирусной ДНК, а также гематологические изменения в разные стадии инфекционного процесса у инфицированных ВЛКРС коров. Приводятся сведения о том, что провирусная ДНК в ЦИК молока коров, инфицированных ВЛКРС, обнаруживаются гораздо раньше гематологических изменений, позволяющих считать их больными лейкозом. Использование образцов молока для проведения молекулярно-генетических анализов по выявлению ВЛКРС в ЦИК является достаточно перспективным направлением для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и весьма информативным при определении статуса животного.