Пути новых сывороточных культуральных питательных сред для выращивания животных клеток и репродукции на них вирусов

В решении современных как теоретических, так и практических проблем ветеринарной биотехнологии, значительное место занимает культивирование клеток in vitro [1]. Они являются важным объектом при проведении вирусологических, биохимических, молекулярно-генетических и других исследований. В связи с этим актуальна проблема разработки условий наиболее эффективного их выращивания [3].

Необходимо отметить, что во время становления технологии культур клеток для их выращивания использовали сначала простые среды или даже физиологический раствор с применением в качестве биологических добавок сывороток крови животных или гидролизатов животного и растительного происхождения. Наибольшее применение в это время для культивирования клеток имела среда 0,5 % гидролизата лактальбумина

(ГЛА) на растворе Хэнкса с добавлением в нее 10% сыворотки крови животных. Данная среда была универсальной для большинства первичных культур клеток сельскохозяйственных животных. Но для отдельных линий клеток млекопитающих, в том числе человека, в дальнейшем разработаны специальные среды, обеспечивающие оптимальный рост этих клеток или возможность их культивирования в бессывороточной среде [2].

В связи с вышеизложенным была проведена работа по экспериментальному обоснованию возможности культивирования перевиваемой линии клеток ЛЭК (легкое эмбриона коровы) на питательной среде, основой которой являлась среда ГЛА. Затем перевиваемую линию клеток ЛЭК, выращенную на экспериментальной среде использовали для репродукции герпесвируса типа I крупного рогатого скота штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» и вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ).

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии и вирусологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Тестовую клеточную культуру ЛЭК /LEK – перевиваемая культура легкого эмбриона крупного рогатого скота/ культивировали на среде, содержащей 90% ГЛА на основе раствора Хэнкса, 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) с добавлением классического комплекса антибиотиков при 37ºC до получения полного монослоя в течение нескольких последовательных пассажей. В качестве контроля была та же линия клеток, но выращенная на питательной среде согласно каталогу коллекции MWIEW, г. Москва. Инфекционную активность вирусов определяли титрованием в культуре клеток ЛЭК. Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча. Было проведено 4 последовательных пассажа вирусов с последующим определением их титра.

Результаты исследований. Адаптация перевиваемой культуры ЛЭК в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в течение 40 последовательных пассажей к опытной среде привела к появлению в монослое длительно не зарастающих «окон» -признаков цитопатического действия, а также нечеткости клеточных границ (рис.1). В ходе опытов показано, что при культивировании ЛЭК в ростовой среде на основе ГЛА происходит сдвиг рН в кислую сторону уже через 24ч инкубации. Ростовые среды на основе МЕМ и ГЛА, используемые нами в ходе эксперимента, различаются между собой по значению буферной емкости. Это при длительном культивировании перевиваемых линий клеток на среде ГЛА может привести к изменениям в хромосомном аппарате и, как следствие, к непредсказуемым изменениям свойств клеток.

1. Монослой ЛЭК через 48ч культивирования на контрольной (А) и опытной (Б) средах. Ок.×10, об. ×10

На момент заражения герпесвирусом морфология клеточной популяции монослоя культур клеток ЛЭК в опыте отличалась от монослоя, выращенного в контроле наличием дегенерированных клеток. Репродуктивная активность герпесвируса была выше в контроле, ЦПД вируса на культуре клеток ЛЭК с экспериментальной средой проявилось на несколько часов позже и менее интенсивно. В контроле инфекционный титр вируса составил 7,52±0,10 lg ТЦД 50/мл , а при культивировании на культуре клеток ЛЭК, выращенной на опытной среде – 5,72±0,07 lg ТЦД 50/мл.

Показано, что инфекционная активность вируса ИРТ на культуре клеток ЛЭК, выращенных на опытной среде составляла 5,5 lg ТЦД50/мл, в то время как в контроле она была 6,5 lg ТЦД50/мл. По литературным данным, вирус ИРТ предпочитает щелочную рН (от 6,0 до 9,0) среду. При репродукции вируса ИРТ на культуре клеток ЛЭК, выращенной с использованием ростовой среды ГЛА, через 72 ч рН становится ниже 6,0, что снижает репродукцию вышеперечисленных инфекционных агентов.

Заключение. Установлена зависимость накопления вируса от состава ростовой среды. Инфекционный титр герпесвируса типа I (штамм «ТК-А (ВИЭВ) - В2») на культуре клеток ЛЭК, выращенной на среде Игла МЕМ, составил на 1,8 lg ТЦД 50/мл выше, чем при культивировании его на ЛЭК, выращенной на среде ГЛА. При культивировании вируса ИРТ было выявлено снижение инфекционной активности на 1 lg ТЦД 50/мл в опыте по сравнению с контролем.

Таким образом, состав ростовой среды не может быть полностью заменен средой ГЛА. Полученные данные являются основанием для прекращения экспериментальной работы по адаптации перевиваемой линии клеток ЛЭК к среде, содержащей 90 % ГЛА и 10% сыворотки КРС.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова – М.: Компания Спутник+, 2000. – 400 с. 2. Методы культивирования клеток/ под ред.: Г.П. Пинаева, М.С.Богдановой. – СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008.-278с.  3. Цыренов, В.Ж. Основы биотехнологии: культивирование клеток человека и животных. Учебнометодическое пособие / В.Ж. Цыренов – Улан-Удэ: ВСГТУ, 2005. – 48 с. 4. Плотникова, Э.М. Культура клеток тканей из паренхиматозных органов плода коровы/ Международная научно - практ. конф. посвящ. 50 –летию ФГУ «ФЦТРБ ВНИВИ» и биологич. безопасность. Биотехнология:  токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность/ Э.М. Плотникова, В.Г. Гумеров, И.М. Ганиев, В.Г. Цыганова, Р.Р. Шарафиева. - Казань.-2010. - С. 447- 450. 5. Плотникова, Э.М. Определение фракционного состава белков экстрактов плодов коров, полученных на основе раствора Хэнкса. Международная научно - практ. конф. посвящ. 50 –летию ФГУ «ФЦТРБ ВНИВИ» и биологич. безопасность/ Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, Е.Ю. Хамзина, Р.Х. Хусаенов/ Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность.- Казань.-2010.-С.450-455. 6. Сборник материалов научная программа тезисы / VII

Международная конференция «Молекулярная медицина и безопасность» / Плотникова А.М., Хамзина Е.Ю., Кириллова Ю.М., Хусаенов Р.Х. – М. – 2010, С.146-147,196.

ПУТИ НОВЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И РЕПРОДУКЦИИ НА НИХ ВИРУСОВ

Цыганова В.Г.

Резюме

Определена возможность репродукции вирусов на перевиваемой культуре клеток ЛЭК, выращенной на ростовой среде гидролизатлактальбумина на основе раствора Хэнкса. Установлена зависимость накопления герпесвируса типа I (штамм «ТК-А (ВИЭВ) -В2») от состава ростовой среды. При культивировании вируса ИРТ было выявлено снижение инфекционной активности на 1 lg ТЦД50/мл в опыте по сравнению с контролем.

THE OPPOFFUNITY OF A REPRODUCTION OF VIRUSES ON LEK CELL CULTURE HAS BEEN GROWN UP TO MEDIUM OF HYDROLYSATLACTALBUMIN ON THE BASIS OF THE HANKS SOLUTION

Tsyganova V.G.