Пыльцевой анализ растений различных генотипов подсолнечника

Введение . Завязываемость семян и продуктивность гибридов подсолнечника в значительной степени зависят от качества и количества пыльцы [15]. Мужская фертильность подсолнечника - это важный селекционный признак, поэтому необходимо проводить цитологические исследования пыльцы для повышения продуктивности растений [1]. Андроцей подсолнечника однолетнего ( Helianthus annuus L.) представлен пятью тычинками со сросшимися в виде трубки пыльниками и свободными нитями, окружающими столбик пестика. Пыльники четырёхгнёздные, объединены попарно в две теки [6]. Пыльцевые зёрна у H. annuus трёхклеточные, трёхбороздно-поровые, имеют сферическую форму и достаточно толстую оболочку [2; 9]. Экзина образует равномерно расположенные крупные шипы до 5 мкм в длину. Окраска пыльцы подсолнечника жёлтая [3]. Средний диаметр пыльцевых зёрен у H. annuus составляет 28-32 мкм [1].

В норме у подсолнечника фертильность пыльцы достигает 90–100 %. Однако цитологические исследования показали, что некоторые генотипы подсолнечника имели наряду с нормально сформированными пыльниками неоднородную по качеству пыльцу. В частности, растения имели до 50 % пыльцевых зёрен с отклонениями: по размеру (микро- и макропыльцевые зёрна) и окраске цитоплазмы [2]. Из литературных данных известно, что морфологическая гетерогенность может приводить к снижению фертильности пыльцы [1]. На качество пыльцы оказывают влияние также способ размножения (особенно апомиксис), неустойчивость кариотипа, наличие хромосомных отклонений [10]. Фертильные зрелые пыльцевые зёрна характеризуются нормальной морфологией и способны к оплодотворению. Морфологические особенности и внутреннее строение пыльцы определяются генетически для конкретного семейства растений [13]. Факторы внешней среды (температура, влажность воздуха, засуха, антропогенное воздействие) также могут значительно воздействовать на мужскую генеративную сферу растений [14].

Фертильность пыльцевых зёрен определяют специальными методами окрашивания: ацетокарминовым, ацетоорсеино-вым, йодным и др. Фертильные зрелые трёхклеточные пыльцевые зёрна после окрашивания ацетокармином или ацето-орсеином приобретают тёмно-красный цвет. Стерильные пыльцевые зёрна почти не окрашиваются или окрашиваются неравномерно. Спермиев в таких пыльцевых зёрнах нет [11].

В работах многих исследователей установлено отрицательное влияние гербицидов на процессы микроспорогенеза, в результате чего снижается фертильность и жизнеспособность пыльцевых зёрен. Однако сельскохозяйственные культуры имеют разную чувствительность к гербицидам [12]. После обработки линий ими-дазолиноно-устойчивого подсолнечника гербицидом Евро-Лайтнинг фертильность пыльцы была в пределах нормы [5]. С другой стороны, обработка гетерозиготных растений подсолнечника Евро-Лайтнингом в фазе закладки генеративных органов во время бутонизации позволила получить мужски стерильные особи. В данном случае гербицид проявил гаметоцидную активность, которая, однако, не наблюдалась у доминантных гомозигот по гену гербицидоустойчивости [4]. У других видов растений отмечено изменение доли основного типа пыльцевых зёрен после обработки гербицидом, т.е. выделялись крупные и мелкие пыльцевые зёрна, а также слипшиеся [16].

Пыльцевой анализ позволяет определить репродуктивный потенциал растений по морфологическим особенностям пыльцевых зёрен: размеру, рисунку экзины пыльцевого зерна, а также его фертильности и жизнеспособности [7; 8]. Все эти биологические признаки пыльцы важны при селекции на повышение уро- жайности подсолнечника. Их изучению посвящена настоящая работа.

Материалы и методы . Исследования проводили в 2019–2020 гг. на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) ВНИИМК, г. Краснодар и в ОСХ «Березанское», посёлок Новоберезанский. Объектом исследования были растения культурного подсолнечника H. аnnuus : четыре гибрида – Фактор, Тайфун, Окси и НК Брио, кондитерский сорт Джинн, две родительские линии гибрида Окси – ВК 876 Б (закрепитель стерильности) и ВК 195 (отцовская Rf-линия). Использовали также многолетний дикорастущий гексаплоидный вид H. tuberosus L. (топинамбур), произрастающий на физиологической площадке ЦЭБ.

Растения гибридов на ЦЭБ ВНИИМК выращивали на 4-рядных делянках при схеме посева 70 × 23 см (60 тыс. шт./га), сорта – 70 × 35 см (40 тыс. шт./га) на селекционном поле в посеве конкурсного сортоиспытания лаборатории селекции гибридного подсолнечника. Растения родительских линий выращивали на однорядных делянках при схеме посева 70 × 35 см (40 тыс. шт./га) в полевом питомнике лаборатории генетики. Растения гибридов на демонстрационном посеве в ОСХ «Березанское» выращивали на 8-рядных делянках при схеме посева 70 × 23 см.

Пыльцевой анализ проводили в лаборатории генетики. Для определения фертильности пыльцу собирали с пяти растений на генотип. Исследуемую пыльцу помещали на предметное стекло, затем с помощью пипетки наносили на неё каплю ацетоорсеина и размешивали иглой так, чтобы все пыльцевые зёрна были в растворе. Выдерживали препарат в таком виде в течение десяти минут, после этого накрывали каплю покровным стеклом и рассматривали препарат под микроскопом при различном увеличении (10х, 40х, 100х). Препарат просматривали под бинокулярным микроскопом Микрос МС 20. В 20 полях зрения подсчитывали количество окрашенных в тёмно-красный цвет, т.е. фертильных, пыльцевых зёрен [5]. Диаметр пыльцевых зёрен, в количестве 200 шт. на генотип, определяли с помощью камеры Горяева по стороне малого квадрата, который имеет длину одной стороны 0,05 ± 0,004 мм.

Для прямого метода определения оплодотворяющей способности пыльцы на разделённые вертикально пополам корзинки ЦМС гибрида Кубанский 93 (тестер) четвёртого дня цветения наносили пыльцу разных генотипов, т.е. использовали т.н. метод сплит-опыления. На одну часть наносили пыльцу гибрида Окси, на вторую – гибрида НК Брио. После созревания корзинок их срезали и в лабораторных условиях обмолачивали индивидуально каждую половину. Завя-зываемость семян определяли как отношение количества выполненных семян в изучаемой половине корзинки к общему числу семян в этой половине корзинки (выполненных и не выполненных). Всего по типу сплит-опыления изучено девять корзинок подсолнечника.

Результаты и обсуждение . В 2019 г. все изученные генотипы: Фактор, НК Брио, Тайфун, ВК 195, Окси, Джинн, ВК 876 Б и H. tuberosus , показали 100%-ную окрашиваемость пыльцевых зёрен ацетоорсеи-ном.

Для изучения фертильности пыльцы важным является не только определение степени окрашиваемости пыльцевых зёрен, но и оценка их морфологической гетерогенности, включая ранжирование по диаметру. Средние значения диаметра пыльцевых зёрен у изученных генотипов варьировали от 35 у гибридов Фактор и НК Брио до 27 мкм у многолетнего дикорастущего вида H. tuberosus при среднем значении 33 мкм. Гибриды НК Брио, Фактор, Тайфун и отцовская линия ВК 195 имели невысокие значения коэффициента вариации (CV), а доля аномальных пыльцевых зёрен в данных образцах не превышала 6 %. Коэффициент вариации и доля аномальных пыльцевых зёрен у кондитерского сорта Джинн были на уровне

• 7 %. У топинамбура коэффициент вариации составил 10 %, а доля аномальных пыльцевых зёрен – 9 %. Для двух генотипов культурного подсолнечника наблюдали морфологическую гетерогенность пыльцы, что выражалось в высоких значениях размаха варьирования (R) для линии ВК 876 Б и гибрида Окси – 30 и 18 мкм, коэффициента вариации – 14 и 11 %, а также в высокой доле аномальных зёрен – 30 и 17 % соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Диаметр пыльцевых зёрен у генотипов подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, г. Краснодар, 2019 г.

Генотип	d, мкм				CV, %	Доля аномальных пыльцевых зёрен, %
	среднее	min	max	R
Фактор	35	28	40	12	6	4
НК Брио (st)	35	30	38	8	5	1
Фактор*	34	30	40	10	6	7
Тайфун*	34	28	40	12	7	5
ВК195	33	28	38	10	6	5
Окси*	33	24	38	14	11	15
Окси	33	24	42	18	11	17
Джинн (st)	32	26	38	12	7	7
ВК876 Б	31	8	38	30	14	30
H. tuberosus	27	20	32	12	10	9

НСР 05   ₂

* – пыльца с растений в опытном хозяйстве «Березанское»

Типичные нормальные пыльцевые зёрна имели округлую форму и диаметр около 33 мкм. Аномальные пыльцевые зёрна можно классифицировать по размерам на два вида: среднеразмерные пыльцевые зёрна, часто деформированные (диаметр 28–29 мкм) и самые маленькие микро-пыльцевые зёрна (16–17 мкм) у линии ВК 876 Б (рис. 1). При этом гетерогенность пыльцы гибрида Окси вызывается очевидно именно его материнской ЦМС-формой ВК 876 А, поскольку отцовская линия ВК 195 обладает гомогенной пыльцой, т.е. признак морфологической гетерогенности является доминантным.

Рисунок 1 – Пыльцевые зёрна подсолнечника линии ВК 876 Б, окрашенные ацетоорсеином

(А – нормальное пыльцевое зерно;

В – среднеразмерное зерно;

С – микропыльцевое зерно)

У гибридов НК Брио, Тайфун и линии ВК 195 на графике вариационной кривой отмечен один пик для диаметра 34– 35 мкм. У гибрида Фактор на графике виден также один пик на уровне 36–37 мкм. Для кондитерского сорта Джинн модальный фенотипический класс составил 32– 33 мкм (рис. 2).

Для гибрида Окси и его материнской линии ВК 876 Б выявлена гетерогенность по диаметру пыльцевых зёрен, что приводит к явному двухпиковому распределению значений признака. В частности, наблюдали основной пик крупных пыльцевых зёрен (36–37 мкм) и пик средних пыльцевых зёрен с диаметром 30–31 мкм. При этом основной пик у этих генотипов соответствовал таковому для других изученных образцов. График варьирования диаметра у дикорастущего многолетнего вида H. tuberosus также характеризовался двухпиковым распределением, однако с левосторонним смещением всех классов за счёт более мелких размеров пыльцевых зёрен. При этом основной пик приходился на 28–29 мкм, а дополнительный – на 24– 25 мкм их диаметра (рис. 2).

Рисунок 2 – Вариационная кривая по диаметру пыльцевых зёрен у подсолнечника (n = 200), 2019 г.

При прямой оценке истинной фертильности пыльцы, т.е. её оплодотворяющей способности, в 2019 г. получены данные о существенных различиях между двумя изучаемыми гибридами. В этом опыте среднее число завязавшихся семянок F1 на разделённую ЦМС-корзинку тестера составило 839 шт., что в целом указывает на хороший уровень гибридизации. Для Окси среднее число нормально сформированных семянок составило 316, а для НК Брио – 523 шт. при НСР05 = 35 шт. Следовательно, пыльца НК Брио привела к большей завязываемости семян на 25 % в F1, чем у Окси со значениями 69 и 44 % соответственно при НСР05 = 12 %.

В 2020 г. средние значения диаметра пыльцевых зёрен у изученных генотипов варьировали от 32 у гибридов НК Брио и Фактор до 26 мкм у H. tuberosus при среднем значении 30 мкм. Генотипы НК Брио, Фактор, Тайфун, ВК 195 и Джинн имели невысокие значения коэффициента вариации и доли аномальных пыльцевых зёрен, не превышающие 8 %. У топинамбура коэффициент вариации составил 12 %, доля аномальных пыльцевых зёрен – 9 %. Для двух генотипов культурного подсолнечника, как и в 2019 г., также наблюдали морфологическую гетерогенность пыльцы, что выражалось в высоких значениях размаха варьирования для линии ВК 876 Б и гибрида Окси – 24 и 15 мкм, коэффициента вариации – 15 и 10 %, а также доли аномальных зёрен – 37 и 34 % соответственно (табл. 2). Высокий процент аномальных пыльцевых зёрен у гибрида Окси также наследовался от материнской ЦМС-формы ВК 876 А. Характер распределения значений диаметра пыльцевых зёрен в 2020 г. у всех генотипов был аналогичен 2019 г.

Таблица 2

Диаметр пыльцевых зёрен у генотипов подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, г. Краснодар, 2020 г.

Генотип	d, мкм				CV, %	Доля аномальных пыльцевых зёрен, %
	среднее	min	max	R
НК Брио (st)	32	27	37	10	6	4
Фактор	32	26	38	12	6	8
Тайфун	31	26	35	9	7	8
Джинн (st)	30	25	35	10	7	8
ВК195	30	25	36	11	7	6
Окси	29	20	35	15	10	34
ВК876 Б	27	9	33	24	15	37
H. tuberosus	26	18	30	12	12	9

НСР 05    1

В целом за два года исследования диаметр пыльцевых зёрен у генотипов культурного подсолнечника варьировал от 34 у гибридов Фактор и НК Брио до 29 мкм у линии ВК 876 Б. Дикорастущий H. tuberosus обладал самой мелкоразмерной пыльцой со средним диаметром 27 мкм (рис. 3).

Рисунок 3 – Диаметр пыльцевых зёрен у генотипов подсолнечника, 2019–2020 гг.

Минимальное значение доли аномальных зёрен было у гибрида НК Брио – 3 %, максимальное – у гибрида Окси и его материнской линии ВК 876 Б – 26 и 34 % соответственно (рис. 4). Остальные генотипы показали долю аномальных пыльцевых зёрен в интервале от 6 до 9 %.

Рисунок 4 – Доля аномальных пыльцевых зёрен у генотипов подсолнечника, 2019–2020 гг.

Выводы . В ходе двухлетних исследований установлено, что диаметр пыльцевых зёрен у гибридов Фактор, НК Брио, Тайфун, Окси, линии ВК 195 и сорта Джинн варьировал от 34 до 31 мкм. Линия ВК876 Б и топинамбур характеризовались наименьшими значениями этого признака – 29 и 27 мкм соответственно. Для двух генотипов культурного подсолнечника – линии ВК 876 Б и гибрида Окси – наблюдали значительную 15

морфологическую гетерогенность пыльцы, что выражалось в соответствующей высокой доле аномальных пыльцевых зёрен – 34 и 26 %. При этом происходило двухпиковое распределение значений диаметра пыльцевых зёрен – главный пик для нормальных зёрен и добавочный пик для аномальных зёрен, включая среднеразмерную и микропыльцу. Морфологическая гетерогенность пыльцевых зёрен гибрида Окси связана с доминантной передачей этого признака от материнской ЦМС-формы ВК 876 А, поскольку отцовская линия ВК 195 обладает нормальной характеристикой пыльцевых зёрен. Пыльца гибрида НК Брио показала достоверно большую (на 25 %) завязываемость семян в скрещивании с ЦМС-тестером, чем у гибрида Окси, что подтверждает предположение о наличии связи повышенной доли аномальных пыльцевых зёрен с пониженной фертильностью пыльцы.