Quorum Sensing и нодуляционная конкурентоспособность ризобий при инфицировании бобовых растений

Один из основных симбиотических признаков ризобий ― их способность конкурировать за образование клубеньков у бобовых растений, проявляемая при совместной инокуляции хозяев несколькими штаммами (нодуляционная конкурентоспособность ― НКС). Молекулярно-генетические исследования выявили полигенный контроль НКС, показали его связь с различными культурально-биохимическими и симбиотическими признаками (структурой клеточной стенки, устойчивостью к антибиотикам и фагам, способностью адсорбироваться на поверхности корней, скоростью образования клубеньков при моноинокуляции растений) и позволили приступить к разработке методов конструирования штаммов ризобий с повышенной НКС (1-5). Вместе с тем закономерности регуляции НКС остаются малоизученными, что затрудняет использование полученных данных в биотехнологических исследованиях, направленных на повышение эффективности биопрепаратов ризобий.

Ранее была предложена гипотеза о том, что скорость миграции бактерий между разными нишами, определяющая их конкурентоспособность, может регулироваться с участием механизма Quorum Sensing (QS-

^∗ Работа поддержана Российским научным фондом, грант 14-26-00094.

регуляция) (6-8). На это указывают экспериментальные данные о колонизации ризобиями клубеньков растений (9, 10), демонстрирующие нелинейную зависимость НКС от общего числа (следовательно, и от пространственной плотности) бактерий в инокулюме. QS-регуляция осуществляется посредством низкомолекулярных сигнальных молекул (аутоиндукторов), которые выделяются бактериями во внешнюю среду и воздействуют на регуляторные белки, вызывая блокировку либо запуск клеточного деления (11-16). В результате популяция может разделиться на группы клеток с разным физиологическим состоянием, в которых процессы размножения либо активированы, либо заблокированы (17). Ранее такая дифференциация была показана для клубеньковых бактерий люцерны ( Si-norhizobium meliloti ), у которых QS-регуляция обеспечивает различие изогенных клеток по активности генов биосинтеза экзополисахаридов, определяющей скорость развития колонии (18).

Цель представляемого исследования ― построение математической модели нодуляционной конкурентоспособности бактериальных штаммов (НКС-модели), учитывающей QS-регуляцию миграционных потоков клеток из инокулюма в клубеньковые ниши бобовых растений.

Построение модели. Ранее было установлено (9), что отношение долей клубеньков, колонизированных двумя конкурирующими штаммами ( k ₁: k ₂) связано с отношением их численностей в единице объема инокулюма ( N ₁: N ₂) уравнением:

где k ₁ + k ₂ = 1; с₁₂ > 0 ― парный индекс НКС, равный отношению числа клубеньков, колонизированных изученными штаммами, при их одинаковой представленности в инокулюме (с₁₂ = k ₁: k ₂, N ₁ = N ₂); 0 < а < 1 ― индекс частотно-зависимого отбора (ЧЗО), определяющий селективные преимущества наиболее редкого штамма при с₁₂ = 1. С уменьшением индекса ЧЗО представленность этого штамма в клубеньках возрастает (11).

Мы полагаем, что в ответ на повышение пространственной плотности каждого штамма QS-регуляция, поддерживая соотношение деля- щихся и покоящихся клеток, смещает его в пользу покоящихся клеток, что ведет к замедлению скорости роста штамма. При моделировании этого процесса мы исходили из того, что миграционные потоки клеток из ниши обитания подвергаются QS-регуляции и нелинейно зависят от пространственной плотности популяций. Эти допущения представляются логичными, поскольку делящиеся клетки расходуют значительно больше получаемых извне энергетических ресурсов, чем покоящиеся клетки, которым эти ресурсы нужны только на поддержание жизнеспособности. Очевидно, что для экономии ресурсов и повышения выживаемости бактериального штамма доля активных клеток в нем должна быть минимальной. Возможно, что QS-регуляция сформировалась в бактериальных популяциях для длительного выживания в условиях дефицита внешних ресурсов.

Интенсивность QS-регулируемого миграционного потока бактериального штамма из инокулюма определяет масштабы накопления клеток на поверхности корней. В свою очередь, различие в количествах клеток на поверхности корней предопределяет распределение штаммов в клубеньках при их колонизации. Следовательно, первопричиной НКС бактериальных штаммов служит QS-регуляция клеточных миграционных потоков. Поэтому при построении НКС-модели мы будем учитывать QS-регуляцию миграционных потоков клеток, функциональный характер которой пред- ставлен в уравнении [1]. Поскольку в ответ на возрастание пространственной плотности каждого штамма QS-регуляция снижает долю мигрирующих клеток, в НКС-модели следует использовать обратно пропорциональную зависимость миграционного индекса (m) от числа клеток каждого штамма:

n m = —M =

N

r

1+

V

N

1-a

N M ,

-1

где N ― суммарное число делящихся и покоящихся клеток штамма в единице объема инокулюма; nM < N — численность способных мигрировать клеток; NМ ― миграционная активность бактериального штам- ма, выраженная плотностью клеток в нише, при которой половина клеток способна мигрировать в соседние ниши (2-nM = N = Nm); 0 < а < 1 — индекс ЧЗО из уравнения [1].

При мультиштаммовой конкуренции для вычисления доли клу- беньков (kJ), колонизированных J-штаммом, необходимо определить долю клеток этого штамма (nMJ) среди мигрирующих клеток всех штаммов:

k J = ⁿ M J ^ n M L ’

L =1

где kJ ― доля клубеньков, колонизированных J-штаммом; nMJ, nML ― число клеток J- и L-штаммов в единице объема инокулюма, рассчитываемое по НКС-модели [2]; S ― число штаммов, участвующих в колонизации клубеньков. Для конкуренции между двумя штаммами из [3] можно полу- чить равенство:

^k 1 : k 2 = ⁿ Ml ^{: n} M2 . [4]

Подставляя [2] в [4] и учитывая, что N ₁ и N ₂ принимаются значительно большими, чем N_M1 и N_M2, получим уравнение, асимптотически близкое к [1]:

al I ЛУа1 I log I /'1 = log I A' I = log М1 l + log 1 I, [5] Vk2 J VnA2 J V NМ-2 J V N2a2 J, 1 J где NM1, NM2 — миграционная активность популяций конкурирующих штаммов; 0 < а1, а2 < 1 — индексы ЧЗО для этих штаммов. Асимптотическая близость [1] и [5] доказывает корректность НКС-модели [2] и допускает использование [2] и [3] для описания мультиштаммовой колонизации корней бобовых растений. В результате для двух конкурирующих штаммов можно рассчитать индивидуальные (с1 = N 1M- a11, с2 = N M1-2a2) и парный (c12 = c1:c2) индексы НКС.

Верификация модели. Используя экспериментальные данные (9, 10), мы определили уровни миграционной активности популяций, а также индивидуальные индексы НКС и ЧЗО для конкурирующих штаммов ризобий (табл.). В качестве показателя адекватности НКС-модели использовался коэффициент детерминации (r2) экспериментальных и расчетных (вычисленных по модели) данных. Близость коэффициента детерминации к единице подтверждает высокую сходимость НКС-модели и экспериментальных данных (см. табл., рис.).

Аналитические зависимости, построенные с помощью НКС-модели для значений параметров из таблицы, показали, что с возрастанием плотности бактерий в инокулюме число мигрирующих клеток растет (см. рис., А, сплошные линии), однако доля мигрирующих клеток (миграционный индекс) уменьшается (см. рис., А, пунктирные линии). Для штамма KIM5s

(см. рис., Б) при плотностях клеток в инокулюме 108 кл/мл и 1010 кл/мл QS-регуляция потока мигрирующих клеток определяется значениями соответственно 2600 и 9300 кл/мл.

Параметры НКС - модели колонизации клубеньков бобовых растений штаммами Rhizobium leguminosarum

Штамм ризобий	Миграционная активность бактерий NM, кл/мл	Индивидуальный индекс НКС, сM	Индекс ЧЗО, аM	Коэффициент детерминации модели, r2
FSS1 (9)	10±1	3,8±0,4	0,42±0,03	0,98
FH20S1 (9)	9±1	4,2±0,5	0,35±0,03	0,93
FS163S (9)	12±1	4,0±0,5	0,45±0,03	0,98
KIM5s (10)	42±2	14,8±1,6	0,28±0,02	0,98
CE3 (10)	6±1	3,5±0,6	0,30±0,02	0,98
Примечание. НКС — нодуляционная конкурентоспособность, ЧЗО — частотно-зависимый отбор.

У родственных штаммов KIM5s и CE3 (см. табл.) индексы ЧЗО близки по величине, и поэтому в уравнении [5] можно принять их равенство a₁ = a₂. В этом случае [5] совпадает с [1], что подтверждает корректность НКС-модели [2]. Если инокулюм штамма FSS1 (см. табл.) содержит 10⁷ кл/мл, а штамма FH20S1 — 10⁵ кл/мл ( N ₁: N ₂ = 100:1), то в клубеньках эти штаммы будут представлены в соотношении k ₁: k ₂ = 93:7, то есть в клубеньках представленность редкого штамма FH20S1 возрастает в 7 раз. Дальнейшее снижение индексов ЧЗО (a₁ = 0,21, a₂ = 0,175) еще более изменит соотношение клубеньков в пользу штамма FSS1 ( k ₁: k ₂ = 80:20).

Как видно из представленных в таблице данных, штамм KIM5s имеет наибольший индивидуальный индекс НКС (с₄ = 14,8). Можно предположить, что QS-регуляция численности этого штамма поддерживает б о льшую интенсивность потока мигрирующих клеток по сравнению с таковой у штамма CE3 (с₅ = 3,5). Поэтому при равном соотношении штаммов KIM5s и CE3 в инокулюме в клубеньках будет преимущественно представлен штамм KIM5s: k ₄: k ₅ = с₄₅ = с₄:с₅ = 14,8:3,5 = 4,2 > 1. Таким образом, повышенный индивидуальный индекс НКС и уровень миграционной активности могут быть объяснены ослабленной QS-регуляцией миграционного потока бактерий из инокулюма.

Анализ выявленных закономерностей позволяет предположить, что бактериальные штаммы с высокими значениями индекса миграционной активности и индивидуального индекса НКС тратят на миграцию клеток большое количество энергетических ресурсов, что сокращает время выживания бактерий. Поэтому повышение НКС у штаммов с помощью генетических методов может повлечь за собой снижение жизнеспособности ри-зобий вне растений и их последующую гибель.

Известно, что низкой выживаемостью вне растений часто обладают штаммы ризобий с повышенной эффективностью симбиотической N2-фиксации (19). Поэтому ЧЗО в пользу редких штаммов может играть важную роль в поддержании эффективного взаимодействия бактерий и растений. Благодаря этому отбору в клубеньках осуществляется преимущественное размножение активных азотфиксаторов, обеспечивающее максимальную продуктивность бобово-ризобиальной системы.

Ранее при изучении фитопаразитарных систем было показано, что растения могут влиять на QS-регуляцию генов вирулентности патогенных бактерий, подавляя инфекционный процесс (20). Возможно, что аналогичный механизм действует и при образовании бобово-ризобиального симбиоза, что позволяет растению регулировать потоки бактерий из окружающей среды в эндосимбиотические ниши и таким образом осуществлять отбор штаммов ризобий по признакам симбиотической эффективности. Проверка этой гипотезы входит в задачи нашей дальнейшей работы.

Распределение конкурирующих штаммов ризобий по клубенькам бобовых растений в зависимости от плотности клеток в инокулюмах (N₁, N₂): k ₁ ― доля клубеньков, образованных штаммом FSS1 (9). Левые оси соответствуют экспериментальным данным ( ^ ) и сплошным линиям, построенным по НКС-модели [2], правые оси ― пунктирным линиям, которые соответствуют значениям миграционного индекса m ₁ (А) и парного индекса НКС с₁₂ (Б), вычисленным по НКС-модели для штамма FSS1.

А. Результаты конкуренции штаммов Rhizo-bium leguminosarum bv. vi-ciae (FSS1, FH20S1, FS163S) с местной почвенной популяцией за нодуляцию конских бобов Vicia faba сорта Ascott (9).

Б. Результаты конкуренции мутантного штамма KIM5s с родительским штаммом CE3 R. legumino-sarum bv. phaseoli за ноду-ляцию фасоли обыкновенной Phaseolus vul garis сорта Puebla 152 при разных соотношениях KIM5s:CE3 в инокулюме (10).

Итак, нодуляционная конкурентоспособность (НКС) ризобий определяется не только преимуществами штаммов при освоении питательных ресурсов в ризосфере бобовых растений, но и миграционной активностью клеток бактерий из ниш обитания. Повышение НКС методами генной инженерии может приводить к возрастанию миграционной активности клеток ризобий и преждевременному расходованию ресурсов почвенной ниши, в которой популяция ризобий обитает вне симбиоза. Поэтому при длительном выживании бактерий в почвенных условиях повышение энергетических затрат на миграцию клеток может повысить риски гибели популяции. Особенности выживания и миграции ризобий необходимо учитывать, в частности, при разработке микробных препаратов длительного действия.