Рафтообразующие липиды мембран митохондрий и хлоропластов галофита Halocnemum strobilaceum

Достижениями последних лет показано наличие дискретных областей в биологической мембране, которые называют липидными или мембранными рафтами, микро- или нанодоменами и т. д. (Simons, Ikonen, 1997; Pike, 2006; Nickels et al., 2017). Несмотря на различные подходы к терминологии и классификации, общепризнано, что такие области мембраны представляют собой небольшие (10–200 нм), гетерогенные, высоко динамичные участки (Pike, 2006). При определённых условиях микродомены могут агрегировать с образованием макродоменов.

Эти области мембран (далее липидные рафты или микродомены) отличаются большей плотностью упаковки, устойчивы к действию детергентов, обладают специфическим составом липидов и белков в сравнении с остальными участками мембран (Laloi et al., 2007). Липидами, образующими рафты, считают стерины (СТ), сфинголи-пиды/цереброзиды (ЦР) и глицеролипиды (ГЛ) с насыщенными жирными кислотами (ЖК) (Lingwood, Simons, 2010; Mongrand et al., 2010).

В настоящее время липидные рафты исследуют с помощью биофизических (Hullin-Matsuda, Kobayash, 2007), микроскопических (Nickels et al., 2017) и биохимических методов (Ozolina et al., 2013). Однако именно биохимические техники позволяют изучать многочислен-

ные виды липидов и белков, присутствующих в микродоменах (Carmona-Salazar et al., 2011).

Первоначально микродомены были обнаружены и хорошо изучены в плазмалемме клеток животных и дрожжей (Harder et al., 1998; Martin, Konopka, 2004). Позже подобные структуры обнаружены в различных внутриклеточных мембранах клеток человека и растений, таких как митохондриальная мембрана (Garofalo et al., 2015), тонопласт (Нестеркина и др., 2016; Ozolina et al., 2013), мембраны эндоплазматического ретикулума (Lingwood, Simons, 2010; Mongrand et al., 2010). В наших предыдущих исследованиях приведены доказательства присутствия рафтов в мембранах хлоропластов (Нестеров и др., 2017).

Многочисленными исследованиями показано, что рафтовые структуры участвуют в различных биологических процессах, таких как трансдукция сигнала (Cacas et al., 2012), сборка мембран (Lang et al., 2001), организация цитоскелета (Caroni, 2001), липидная сортировка и об-мен/рециркуляция белка (Simons, Ikonen, 1997; Laloi et al., 2007).

Для растительных клеток установлено, что липидом рафтов включает все структурные и сигнальные липиды, характерные для животных клеток (Mongrand et al., 2010). Показано, что при помощи рафтов в клетки-хозяева растений вторгается широкий спектр патогенов, включая вирусы, бактерии и прионы (Bagam et al., 2017). Процесс вторжения происходит за счет рецепторов, локализованных в липидных рафтах (Ott, 2017).

Кроме того, доказано участие рафтов в ответе растительной клетки на биотическое и абиотиче- ское стрессовое воздействие (Валитова и др., 2010). Однако, по-прежнему существенно меньше данных о физиологической значимости рафтов в растительной клетке, особенностях состава их липидов и белков, количестве, изомерном положении и распределении в бислое и пр. (Ma-linsky et al., 2013).

Важной особенностью галофитов, приспособившихся к засолению почвы, является быстрый транспорт поглощенных неорганических ионов (Cosentino, 2008; Bassil et al., 2011), дифференциальное распределение в тканях надземных органов (Балнокин и др., 2004), а также защита активно метаболизирующих частей растения и генеративных органов от накопления Cl- и Na+ путем их депонирования в отдельных органах, тканях и клеточных компартментах. Механизмы, регулирующие транспорт ионов из среды в клетку, связаны с защитными свойствами мембран, что является дополнительным аргументом в поиске рафтовых структур, их идентификации и анализе состава рафтообразующих липидов.

Известно, что рафты, полученные из определенного типа мембран, отражают их специфику, т.е. состав их компонентов сходен (Mongrand et al., 2010). Так, в липидных рафтах, выделенных из плазматической мембраны клеток Populus tremula, обнаружен идентичный состав липидных компонентов, но с преобладанием доли сфинголипидов и СТ (Bessueille et al., 2009). Липидные рафты тонопласта Beta vulgaris содержали в два раза меньше структурных компонентов, присущих мембране, и в 1,5–2 раза больше сфинголипидов и СТ (Ozolina et al., 2013). Рафты, полученные из митохондрий Т-клеток человека отличались высоким содержанием ганглиозидов и СТ при относительно низких значениях ФЛ (Garofalo et al., 2015).

Цель данной работы – исследовать состав липидов рафтовых структур в мембранах хлоропластов и митохондрий однолетних побегов соленакапливающего галофита Halocnemum strobilaceum Bieb.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал отбирали в бассейне соленого оз. Эльтон (Волгоградская обл., Россия) в июне 2016 г. Однолетние побеги в количестве 200 г сырой массы, собранные с 15–20 типичных растений, замораживали в жидком азоте и хранили до начала анализов. В лабораторных условиях с помощью метода дифференциального центрифугирования осуществляли, как описано ранее, выделение хлоропластов и митохондрий (Розенцвет и др., 2012). Контроль чистоты фракций хлоропластов и митохондрий проводили с использованием инвертированного биологического микроскопа Axio observer Z1 («Carl Zeiss», Германия), а также по содержанию маркерных липидов – сульфохиновозилдиацилглицерола в сумме пластидных липидов в случае с хлоропластами и дифосфатидилглицерола в сумме фосфолипидов в случае с митохондриями.

Для выделения детергент устойчивой области мембран (липидных рафтов) фракции хлоропластов и митохондрий солюбилизировали 1% Тритоном Х-100, 30 мин при 4°С, вносили под градиент сахарозы 35–25–15–5% и центрифугировали в течение 2-х ч при 200000 g (Ozolina et al., 2013). После центрифугирования в области 15% градиента сахарозы были выявлены опалесцирующие зоны.

Экстракцию и анализ липидов из зон опалесценции, а также из хлоропластов и митохондрий проводили, используя методические рекомендации М. Кейтса (1975).

ЖК анализировали в виде их метиловых эфиров, используя газовый хроматограф Кристалл-5000.1 («Хроматэк», Россия), в изотермическом режиме на капиллярной колонке Rtx Т-2330 («Restek», США) длинной 105 м и диаметром 0,25 мм. Температура колонки – 180°С, испарителя и детектора – 260°С, скорость тока газа-носителя (гелий) – 2 мл/мин.

Результаты представлены в виде средних величин и их стандартных ошибок. Расчеты проводили с помощью программ Statistica 6.0 for Windows, Past 3 и Microsoft Excel 2003. Сравнение количественных характеристик данных проводили с использованием дисперсионного анализа (One-way ANOVA) с последующим использованием критерия Тьюки для сравнения средних значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Микродоменные участки мембран, устойчивые к действию детергента, были обнаружены в результате дифференциального центрифугирования фракций хлоропластов и митохондрий. Появление зоны опалесценции в области 15% градиента сахарозы стало одним из первых признаков, в которой, судя по литературным данным, содержится наибольшее количество рафтовых структур (Mongrand et al., 2010). Изучение особенностей состава липидов рафтовых структур в эндомембранах проводилось в сравнении с составом липидов соответствующих органелл.

Исследования показали, что основная доля липидов в мембранах хлоропластов приходилась на ГЛ и составляла 95% от суммы мембранных липидов хлоропластов. На долю СТ+ЦР приходилось не более 5%. В составе липидов, полу- ченных из опалесцирующих зон, соответствующих рафтовым структурам, также преобладали ГЛ – 73%, но доля рафтоспецифичных липидов

(СТ+ЦР) была в 5 раз выше, чем у органелл и достигала третьей части от суммы мембранных липидов (табл. 1).

Таблица 1

Состав липидов субклеточных мембран и их рафтов эугалофита H. strobilaceum Composition of lipids of subcellular membranes and their rafts of euhalophyte H. strobilaceum

Классы липидов	Содержание липидов, % от суммы
	хлоропласты	рафты хлоропластов	митохондрии	рафты митохондрий
ГЛ	95±9a	73±4b	86±8a	26±3c
ЦР	3±0b	7±1a	8±1a	9±1a
СТ	2±0d	20±2b	6±0c	65±5a

Примечание . Каждое значение представляет собой среднее ± ст. ош. ( n = 20). Разные буквы указывают на разницу между органеллами и рафтами (P < 0,05).

Доля ГЛ в мембранных липидах фракции митохондрий составляла 86 % от суммы всех выделенных липидов (табл. 1). Сумма СТ и ЦР равнялась 14%. В рафтах, выделенных из мембран митохондрий, рафтообразующие липиды становятся доминирующим компонентом и составляют уже 74%. В отличие от хлоропластов доля СТ в составе рафтообразующих липидов митохондриальной фракции была преобладающей – 65%. Похожие результаты были получены при исследовании рафтов, выделенных из митохондрий Т-клеток человека, которые отличались высоким содержанием ганглиозидов и СТ при относительно низких значениях ФЛ (Garofalo et al., 2015).

Еще одной особенностью состава липидов рафтов является высокая степень насыщенности ЖК. Так доля насыщенных ЖК в липидах рафтов мембран хлоропластов составила 50%, в рафтах мембран митохондрий – 65% от суммы ЖК. Анализ ЖК липидов фракций хлоропластов и митохондрий показал высокую степень их ненасыщенности – около 70% от суммы ЖК (табл. 2).

Таблица 2

Состав ЖК липидов субклеточных мембран и их рафтов эугалофита H. strobilaceum Composition of FAs of lipids of subcellular membranes and their rafts of euhalophyte H. strobilaceum

ЖК	Содержание, % от суммы ЖК
	хлоропласты	рафты хлоропластов	митохондрии	рафты митохондрий
<С14:0	0,3±0c	2,0±0,1b	0,2±0d	2,8±0,2a
С14:0	–	6,5±0,5a	–	7,5±0,5a
С14:1	–	0,8±0,1a	–	1,0±0,1a
С15:0	0,1±0b	2,4±0,2a	0,1±0b	2,8±0,2a
С15:1	–	0,7±0a	–	0,6±0b
С16:0	24,0±1,5c	30,8±2,5b	24,0±1,8c	39,0±3,2a
С16:1	1,4±0,1c	11,7±1,1a	1,4±0,1c	7,4±0,7b
С17:0	0,2±0d	0,6±0b	0,4±0c	0,8±0a
С17:1	–	0,9±0,1a	–	1,1±0,1a
С18:0	3,1±0,2c	10,0±0,8b	3,5±0,2c	14,6±1,0a
С18:1	8,0±0,5c	24,0±1,7a	12,0±1,1b	13,0±0,9b
С18:2	11,7±1,2b	5,1±0,3c	19,1±2,0a	3,2±0,2d
С18:3	48,4±3,2a	0,6±0c	36,0±1,5b	0,1±0d
С20:0	1,0±0b	0,1±0c	1,5±0,1a	0,1±0c
>С20:0	0,8±0d	2,3±0,1b	1,7±0,1c	6,9±0,5a
X	1,0±0,1b	1,5±0,2a	0,1±0c	0,1±0c
Сумма насыщенных ЖК	28,4	50,4	29,5	64,8
Сумма ненасыщенных ЖК	69,5	43,8	68,5	25,4

Примечание . Х – неизвестные ЖК. Каждое значение представляет собой среднее ± ст. ош. ( n = 20). Разные буквы указывают на разницу между органеллами и рафтами (P < 0,05).

Полученные данные являются еще одним свидетельством того, что полученные рафтовые структуры, состоят из более плотно упакованных слоев липидов, чем мембраны, из которых они выделены. Основной насыщенной ЖК для мембран органелл – митохондрий и хлоропластов, была пальмитиновая ЖК (С16:0), доля которой составляла 24% от суммы ЖК. Для рафтов хлоропластов и митохондрий относительное содержание С16:0 увеличивалось до 31% и 39%, соответственно. Относительный вклад другой насыщенной ЖК – стеариновой (С18:0), также увеличивался до 10–15 % против 4%. Содержание главной ненасыщенной ЖК (линоленовой С18:3) в рафтах мембран обеих органелл отмечено в следовых количествах, в то время как в липидах фракции хлоропластов и митохондрий содержание данной ЖК составляло 48% и 36%, соответственно. Кроме того, в составе ЖК рафтов выявлено низкое относительное содержание линолевой ЖК (С18:2) – не более 5%, тогда как в мембранных фракциях митохондрий и хлоропластов относительное содержание С18:2 было 19% и 12%, соответственно.

Наряду с повышенной насыщенностью ЖК в липидах рафтов установлено высокое содержание моноеновых ЖК, которые в сумме составили 38% (для хлоропластных рафтов) и 23% (для митохондриальных рафтов). Основной среди моно-еновых ЖК была олеиновая ЖК (С18:1) – 24% (рафты хлоропластов) и 13% (рафты митохондрий) от суммы ЖК.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как отмечалось выше, характерными чертами рафтовых структур являются – устойчивость к детергентам, плотность упаковки, особый состав белков, липидов и ЖК. Зоны опалесценции, свидетельствующие о концентрации рафтов, были обнаружены при выделении рафтов как из фракции митохондрий, так и хлоропластов.

Анализ состава липидов фракций хлоропластов и митохондрий и их рафтов показал, что состав структурных компонентов рафтов и мембран, из которых они получены, сходен и в рафтовых структурах наблюдается тот же качественный состав компонентов, но обогащенный СТ и/или ЦР. Эти данные согласуются с литературными данными. Например, анализ липидов фракции плазмалеммы и выделенных из нее рафтов культуры клеток гибридной осины показал сходство их состава (Bessueille et al., 2009). При этом рафты на 30 % были больше обогащены сфинголипидами и практически вдвое СТ.

Предполагают, что высокое относительное содержание СТ в мембране или ее части может быть связано с защитной реакцией растительной клетки на колебания факторов окружающей среды, в которых произрастают растения (Beck et al., 2007). Изменение в содержании и составе СТ может приводить к множественным дефектам роста и развития, как показано на растениях Ara-bidopsis thaliana (Clouse, 2000). Данное утверждение особенно справедливо для галофитов, которым помимо засоления среды, приходится переносить и достаточно суровые засушливые условия в сочетании с высоким уровнем освещенности (Розенцвет и др., 2017).

Наряду с общеизвестным фактом о повышенной насыщенности ЖК в липидах рафтов, нами установлено высокое содержание моноеновых ЖК, основной среди которых была олеиновая ЖК (С18:1). В литературных источниках отмечено, что дикий тип океанических сине-зеленых водорослей из рода Synechococcus, толерантных к NaCl, содержит до 50% мононенасыщенных ЖК и практически такой же % насыщенных ЖК в составе липидов (Allakhverdiev et al., 2001).

В целом микродомены отличаются низкими значениями ненасыщенности ЖК за счет уменьшения количества полиненасыщенных ЖК и увеличением насыщенных и мононенасыщенных ЖК.

В наших экспериментах мембраны хлоропластов и митохондрий тоже отличались высокой степенью ненасыщенности, но при этом их микродомены были насыщенными, что способствует более плотной упорядоченности липидов. Возможно, что наличие в мембранной системе органелл H. strobilaceum рафтов, с одной стороны упорядочивает их, а с другой – способствует сохранению высокой степени ненасыщенности липидов, т.е. позволяет тем самым осуществлять хлоропластам и митохондриям их функции и одновременно сохраняет их целостность.

Таким образом, полученные данные, основанные на устойчивости к детергенту отдельных участков мембран и особом составе липидов и ЖК, дают основание заключить о существовании рафтовых структур в мембранах хлоропластов и митоходндрий галофитного растения H. strobi-laceum. Рафтовые структуры обогащены СТ (десятикратно) и/или ЦР (двукратно, в случае с хлоропластными рафтами) в сравнении с органеллами, из которых они были выделены. Липиды микродоменов имеют вдвое большую степень насыщенности ЖК. Подобные особенности структурной организации микродоменов мембран хлоропластов и митохондрий могут быть связаны с солеустойчивостью галофита H. strobi- laceum, эволюционно приспособленного к аккумулированию солей в своих клетках.