Раневое покрытие на основе коллагенламиновой матрицы

Несмотря на существующие достижения в области регенеративной медицины, заживление ран кожи остается актуальной проблемой. Для полноценного замещения поврежденных участков кожи необходимо использование тканеинженерных конструкций, состоящих из эпидермального и дермального компонентов кожи. Использование биологически активных стимулирующих средств с направленным действием на процессы регенерации и эпителизации является очень действенным способом заживления ран, в том числе вызванных ожогами [1]. В настоящее время использование материалов основывается на биодеградации полимеров: альгинатов, коллагена, желатина, хитозана, фиброинов шелка, полиэфиров бактериального происхождения — полиоксибутиратов и их сополимеров [2]. Данные материалы биосовместимы и выполняют роль эффективных биостимуляторов. Сегодня предложены коллагенсодержащие препараты, которые в качестве антисептического компонента содержат в себе метронидазол либо доксициклин или хлоргексидин биглюконат [3]. Коллаген, являясь белком соединительной ткани, играет важную роль в осуществлении репаративных свойств. Заживление любой раны — это восстановление соединительной ткани кожи тела. Основным компонентом в процессах заживления кожных покровов тела является коллаген [4]. Причиной усиления коллагеном роста соединительной ткани будет стимуляция продуктов его распада. Важным преимуществом разрабатываемых средств на основе коллагена является их способность к биоадгезии при контакте с тканями организма и его последующей биодеградации.

В наши дни в качестве перевязочного материала разработаны коллагеновые губки, в сочетании с эластинами, фибронектинами и гликозаминогликанами, обладающие способностью впитывать экссудат покровной ткани и защищать от механических повреждений и присоединения вторичной бактериальной инфекции. Данное покрытие стимулирует дермальное и эпидермальное ранозаживле-ние кожных покровов тела [5, 6].

Кожные покровы являются наиболее обширным органом человека по измеряемой поверхности тела. Расположение кожи на границе наружной и внутренней сред определяет ее защитные, барьерные и другие функции. Кожные покровы защищают организм от неблагоприятных воздействий внешней среды, защищают от действия патогенных микробов и вирусов, а также кожа позволяет получать осязательную информацию, воспринимать термические и механические действия посредством осязания покровов тела. Отдельные повреждения составляющих элементов кожных покровов при травме или заболеваниях могут приводить к тяжелым последствиям вплоть до смертельного исхода. Поэтому развива- ются следующие направления науки, такие как тканевая инженерия и регенеративная медицина, одна из целей которых — разработка новых способов регенерации поврежденных тканей и органов, в том числе кожи [7]. Сегодня предполагается создание новых искусственных биологически совместимых средств, которые выступают в качестве раневых покрытий нового поколения и служат основой для получения новых эквивалентов кожи, которые обладают свойством замещать поврежденные участки тканей.

Цель исследования

Объектом исследования являются коллаген-ламининовые матрицы для образования тканеинженерных конструкций. Цель работы — разработка коллагенламининовой матрицы для задач тканевой инженерии. Одно из действий регенеративной медицины будут клеточные технологии. Цель в данном случае не только в трансплантации живых клеток в поврежденные ткани, но и в репарации структуры и свойств кожи, в усилении восстановительных процессов и создании окружения для реализации всех свойств тканей и клеток. Чтобы решить данные задачи, применяются способы тканевой инженерии [8]. Эти методы решают задачи регенеративной медицины и рассматривают вопросы качества жизни человека, повышения ее длительности за счет восстановления строения и функций тканей и органов.

Одним из способов, направленных на восстановление поврежденных или утраченных тканей, служит применение тканеинженерных конструкций, созданных на основе клеточных технологий. Большинство исследований направлено на изготовление растворов коллагена и дальнейшее его использование в приготовлении лекарственных средств. Коллаген — основной белок соединительной ткани, имеющий важные биохимические свойства, главной из которых является репаративная [9]. Коллаген интересен еще и тем, что имеет свойства вновь образованных полимеров (прочность, эластичность, способность формировать различные структуры и др.), а также функции природных полимеров (способность к биодеградации и образованию обратимых комплексов с лекарственными средствами, тем самым пролонгируя их действие).

Материалы и методы

Коллаген первого типа выделяется из сухожилий хвостов крыс. С этой целью берутся взрослые крысы линии Вистар весом от 300 грамм, содержащиеся в условиях вивариев при лабораториях, без инфицирования, влияния паразитов и т. д. Хвосты крыс отделяются после умерщвления животных, хвосты можно хранить в течение нескольких лет в морозильной камере при t̊°-20 °С. Перед выделением коллагена крысиные хвосты вначале отмывают при помощи моющих средств и стерилизуют в 70%-ном этиловом спирте в течение 24 часов перед экстрагированием коллагена. Все манипуляции проводятся в стерильных условиях. Кожу с хвоста крысы снимают при помощи скальпеля и пинцета и далее крысиный хвост разрезается на порции по 2–3 см. Полученные таким образом куски хвоста инкубируются в 70%-ном этиловом спирте в течение 15 минут. Затем сухожилия извлекают из крысиных хвостов и расщепляют на тонкие волокна и помещают в сосуд со стерильным раствором 0,1%-ной ледяной уксусной кислоты. При этом коллаген начинает экстрагироваться в раствор практически сразу, в этом случае раствор приобретает вязкость и окраску по типу синевато- опалесцирующей дымки. Для получения необходимой концентрации и консистенции раствора сухожилия с одного хвоста следует помещать в 100–150 мл раствора. Затем раствор инкубируют при t°+4°С в течение одного месяца. Потом раствор коллагена центрифугируют (при комнатной температуре 1 час при 1500g≈4000 об./мин при радиусе ротора 10 см) для осаждения нерастворенных волокон коллагена. Образовавшийся раствор сливают в стерильные емкости для консервации. Концентрацию полученного раствора определяют, выпарив в суховоздушном термостате водную фракцию и определив вес осадка. Раствор коллагена можно считать нормальным при концентрации коллагена не ниже 1мг/мл (обычно получается 3–5 мг/мл).

Полимеризация коллагена происходит быстро, в течение 3–5 минут, поэтому все процедуры необходимо проводить вовремя, желательно на льду, для этого следует нейтрализовать кислый раствор. Добавив необходимые ингредиенты и смешав их, чашку Петри с коллагеновым гелем ставят в инкубатор с t°+37 °C на несколько часов.

Следующим этапом является процесс высаживания клеток на поверхность полученной пленки: на коллагеновый гель высаживают клетки линии HaCaT в плотности 10–40 тысяч клеток на 1 см². Клетки линии HaCaT являются имморта-лизованными кератиноцитами человека, они хорошо культивируются и широко используются в научных исследованиях.

После достижения необходимой плотности клеток получившийся коллагенламининовый матрикс фиксируют в 4%-ном параформальдегиде в течение 24 часов при t°+4 °С. При этом все белки композиции соединяются между собой, образуя нерастворимый комплекс, а клетки инактивируются. После необходимой фиксации трансплант отмывается от формальдегида при помощи стерильного раствора фосфатно-солевого буфера (PBS), 3 раза по 15 минут с покачиванием на орбитальном шейкере. Далее проводят этап децеллюлирования матрикса. Готовый матрикс можно хранить в течение одного месяца при t°+4 °С в растворе PBS либо два года в высушенном состоянии, замораживая при t°-20 °С.

Полученная конструкция представляет устойчивую белковую композицию, которая состоит из коллагена первого типа и ламинина базальной мембраны. Коллаген составляет основу транспланта, ламинин закрывает ее в виде базальной мембраны. Матрикс стерильный, лишен какой-либо клеточной составляющей.

В настоящее время используются новые препараты в медицине, способные выполнять нужные функции и разлагаться на простые составляющие, выводиться организмом в определенное время, не оказывая токсическое действие на организм в целом. Большинство травм и заболеваний, связанных с ранением кожи, создают долгосрочную основу для спроса на биосовместимые и биодеградируемые медицинские материалы 1 . Поэтому средства, применяемые как тканеинженерные конструкции, должны иметь свойства, в основе которых лежит биосовместимость. Многие полимеры естественного происхождения обладают высокой биологической активностью, усиливают восстановление тканей без проявления новообразований соединительной ткани в месте повреждения [10].

Для разработки новых кожных покрытий применяют коллаген, ламинины и другие компоненты внеклеточного матрикса, которые обладают высокой биосовместимостью и способны оказывать определенное действие на соприкасающиеся ними клетки [11]. Ламинины — семейство крупных адгезивных гликопротеинов, которые являются главными компонентами базальных мембран и способны выполнять ряд функций. Основной задачей ламинина являются связывание клеток и моделирование клеточного поведения.

Апробация полученного ранозаживляющего матрикса

Пациентка: Б. 55 лет ДЗ: Вульгарная пузырчатка, распространенная форма. Анемия средней степени тяжести. Диагноз выставлен в 2016 г. В течение заболевания периодические обострения до 2–3 раз в год, последнее обострение с июня 2019 г. Находилась на госпитализации с 08.07 до 26.09.2019 г. без особой положительной динамики, на суточной дозировке преднизолона: 40 мг/сутки. На рисунке 1 показано состояние до наложения коллагенламиновой матрицы. В июле и августе проводилось наложение на пораженные участки кожи раневого покрытия NovoSkin, в течение трех недель. На рисунке 2 показано начало эпителиза-ции от 19.07.19 г. после наложения коллагенламиновой матрицы, на рисунке 3 повторное наложение коллагенламиновой матрицы от 23.07.2019 г., на рисунке 4 показан результат на 2-й день наложения коллагенламиновой матрицы.

Рис. 1. До наложения коллагенламиновой матрицы

Рис. 2. На 3-й день после наложения коллагенламиновой матрицы

Рис. 3. Повторное наложение коллагенламиновой матрицы

В. П. Саганов, Ю. С. Балханов, Е. Б. Эрдынеева, А. В. Бодоев, Т. Ю. Синицына. Раневое покрытие й

Рис. 4. На 2-й день после повторного наложения коллагенламиновой матрицы

Рис. 5. На 7-й день повторного наложения коллагенламиновой матрицы

Рис. 6. На 11-й день после повторного наложения коллагенламиновой матрицы

Рис. 7. На 17-й день после повторного наложения коллагенламиновой матрицы

На рисунке 5 показан результат на 7-й день наложения повязки. На рисунке 6 результат эпителизации от 02.08.2019 г., на 11-й день наложения повязки, на рисунке 7 — результат от 08.08.2019 г., на 17-й день наложения повязки.

Через две недели произошла практически полная эпителизация раневой поверхности. В ходе лечения произошло уменьшение дозировки преднизолона до 10 мг/сутки.

Заключение

Нами получены результаты по заживлению поврежденных участков кожи, которые свидетельствуют о том, что создана новая репаративная тканеинженерная конструкция, обладающая эффективностью и высокой скоростью заживления ран, благодаря целенаправленному росту регенерирующих тканевых структур. Анализируя изложенное, можно отметить, что посредством ламинина и коллагена подтверждается активное положительное влияние на процессы заживления. Разработанный биологический материал и нетоксичная коллагенламининовая композиция направлены на регенерацию раны в комбинации с полимерной подложкой и продуктом синтеза кератиноцитов организма человека, при этом клеточный компонент удален. Новый продукт отличается простым способом изготовления и длительным сроком хранения. Все это позволяет рекомендовать полученную тканеинженерную конструкцию к внедрению в производство.