Распространение и идентификация картофельной цистообразующей нематоды в агроландшафтах Республики Карелия

В почвах Карелии встречаются виды цистообразующих нематод семейства Heteroderidae , среди которых наибольшее распространение получил вид Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 [1], являющийся объектом внутреннего и внешнего карантина растений. На территории республики картофельная цистообразующая нематода впервые была выявлена в 1976 году [4], и за 30 последующих лет ареал ее распространения продвинулся до 67° с. ш. [2]. Для предотвращения дальнейшего распространения картофельной цистообразующей нематоды установлен карантинный фитосанитарный режим, запрещающий вывоз культурных растений в другие регионы страны¹.

Потери урожая картофеля от картофельной цистообразующей нематоды составляют 30,

а иногда 80…90 % [6]. Особенно большой ущерб глободероз причиняет при возделывании культуры в ЛПХ. Нарушения технологии выращивания (несоблюдение севооборота, отсутствие нематицидов, длительное использование восприимчивых сортов и др.), недостаточная информированность населения о карантинном объекте и способах его распространения являются основными причинами увеличения зараженности земельных участков. Иначе обстоит дело в КФХ и сельскохозяйственных предприятиях, которые предпринимают меры по предотвращению заноса фитогельминта и локализации очагов его распространения, поэтому здесь доля зараженных площадей и снижение урожая картофеля гораздо меньше.

В настоящее время для идентификации цистообразующих нематод широко используют морфометрический и молекулярный методы диагностики [3]. При определении фитогельминтов по морфологическим признакам (форма, длина и ширина тела цисты и др.) в случае принадлежности их к карантинным объектам (G. rostochiensis, G. pallida) дополнительно привлекают молекулярные методы. Так, в отношении G. rostochiensis в ФГБУ «ВНИИКР» по РК применяют ПЦР-Flash, который основан на различиях в строении ДНК тестируемого и контрольного объектов. На основе результатов ПЦР-амплифи-кации ДНК делают вывод о видовой принадлежности анализируемого образца.

Цель настоящей работы – изучить современное состояние распространенности G. rostochien-sis в агроландшафтах Карелии и подтвердить ее видовую принадлежность при проведении фито-гельминтологического анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили в течение 2012–2016 годов на базе Карельского филиала ФГБУ «ВНИИКР». Материал для исследований – жизнеспособные цисты нематоды, выделенные из образцов почвы, отобранных с земельных участков сельскохозяйственных предприятий, КФК и ЛПХ РК. Почвенные пробы отбирали согласно методическим рекомендациям2. Цисты из почвы выделяли вороночным методом, видовую принадлежность устанавливали путем проведения морфометрического анализа3. На основе изготовленных анально-вульварных пластинок определяли наличие V-образной кутикулярной складки между анусом и вульвой, а также рассчитывали индекс Гранека. Исходя из нашего опыта, вышеуказанный метод целесообразно применять при большом числе цист (5 и более цист/100 см3) в пробе почвы. Этот метод предполагает приготовление нескольких качественных анально-вульварных пластинок от одного образца. При единичном обнаружении цист изготовление микропрепарата довольно затруднительно, поэтому, согласно стандарту4, целесообразно использовать молекулярный метод диагностики с флуоресцентной детекцией результатов ПЦР-амплификации ДНК непосредственно после завершения реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Земельные ресурсы РК по почвенно-климатическим условиям делят на три зоны. Северная зона, наименее освоенная в сельскохозяйственном отношении, включает Лоухский, Кемский, Муезерский, Сегежский, Беломорский муниципальные районы, Калевальский городской округ. Наиболее благоприятными для возделывания картофеля являются центральная (Медвежьегорский, Пудожский, Кондопожский и Суоярвский муниципальные районы) и южная (Прионежский, Пряжинский, Олонецкий, Питкярантский, Лахденпохский, Сортавальский муниципальные районы, Петрозаводский городской округ) зоны.

За последние пять лет фитогельминтологичес-кому обследованию были подвергнуты земельные участки на территории 16 муниципальных районов РК, причем максимальное количество площадей было проверено в 2012 году. Меньше всего обследованных площадей приходится на северную зону, где отсутствуют сельскохозяйственные предприятия и сокращены объемы выращивания картофеля в ЛПХ. По данным территориального управления Россельхознадзора, на 01.01.2015 на территории РК картофельная цистообразующая нематода зарегистрирована на площади 145,6 тыс. га5.

Анализ почвенных образцов, отобранных с земельных участков хозяйствующих субъектов различных форм собственности, показал неоднородность распространения картофельной цистообразующей нематоды на территории республики (табл. 1, 2). Так, в сельскохозяйственных предприятиях и КФХ на долю зараженных глобо-дерозом почв приходилось до 46,7 % площадей. Наибольшее распространение G. rostochiensis выявлено в почвах центральной и южной зон

Таблица 1

Динамика встречаемости цист нематоды в почвах сельскохозяйственных предприятий и крестьянских фермерских хозяйств РК, % (по данным ФГБУ «ВНИИКР» по РК, 2012–2013, 2015–2016 годы)

Административный район	Год исследования
	2012	2013	2015	2016
Кондопожский	46,7	0,0*	–	0,0
Медвежьегорский	35,9	–	–	49,1
Олонецкий	6,8	19,9	0,0	14,3
Прионежский	3,6	7,8	3,1	0,0
Пряжинский	41,0	6,5	0,0	5,1
Сортавальский	7,5	5,0	–	0,0
Питкярантский	–	–	–	0,00

Примечание. * – 0,0 – отсутствие цист нематоды в обследуемых почвах, «–» – отсутствие обследованных площадей.

Таблица 2

Динамика встречаемости цист нематоды в почвах личных подсобных хозяйств РК, % (по данным ФГБУ «ВНИИКР» по РК, 2012–2016 годы)

Административный район	Год исследования
	2012	2013	2014	2015	2016
Беломорский	61,2	–	–	–	–
Калевальский	73,6	–	–	–	–
Кемский	60,0	–	–	–	–
Кондопожский	86,9	90,0	97,9	93,7	–
Лахденпохский	84,2	80,0	33,3	67,5	90,0
Лоухский	64,7	–	–	–	–
Медвежьегорский	61,5	87,2	68,0	97,1	100
Муезерский	95,4	100,0	–	–	–
Олонецкий	68,8	15,0	71,4	52,5	57,9
Прионежский	54,3	96,7	79,5	91,8	78,8
Пряжинский	88,4	81,5	86,7	65,2	–
Пудожский	84,1	85,4	81,2	88,5	71,0
Сегежский	95,8	96,1	100,0	–	–
Сортавальский	41,0	46,8	–	–	–
Суоярвский	87,5	94,3	–	87,1	–
Питкярантский	75,0	75,0	85,7	93,5	69,5

Примечание. «–» – отсутствие обследованных площадей.

(Кондопожском, Пряжинском и Медвежьегор -ском районах). Часть обследованных площадей Олонецкого, Прионежского и Сортавальского районов свободны от фитогельминта. В ЛПХ установлены более широкое распространение нематоды и наличие очагов глободероза, особенно в почвах Кондопожского, Сегежского, Суоярвского районов. Здесь в различные годы обследования площадей доля зараженных почв варьировала от 86,9 до 100 %.

По результатам фитогельминтологического анализа установлены особенности морфологии цист карельской популяции G . rostochiensis (табл. 3).

Размеры цист нематоды карельских популяций G. rostochiensis в целом соответствуют ниж- нему порогу морфометрических параметров цист из других регионов страны и зарубежья.

Анализ анально-вульварных пластинок (рис. 1) показал принадлежность тестируемых образцов

Рис. 1. Анально-вульварная пластинка цистообразующей золотистой картофельной нематоды

Таблица 3

Морфометрические показатели выделенных цист G. rostochiensis

Показатели	Литературные данные			Результаты исследований по годам
	И. П. Казаченко, 1993 [5]	A. M. Golden, M. S. Ellington, 1972 [5]	СТО ВНИИКР 6.001–2010	2013	2014	2015	2016
Длина тела (без шеи), мкм	467…725 (589)	450…990 (680)	445 ± 50	444,3	439,5	454,8	453,7
Ширина тела, мкм	430…713 (559)	250…810 (540)	382 ± 61	381,2	383,0	399,7	385,7
Отношение длины к ширине	0,9…1,3 (1,04)	1,0…1,8 (1,27)	_	1,2	1,2	1,1	1,2
Индекс Гранека	2,1…5,4 (3,7)	2,0…7,0 (4,5)	3,6 ± 0,8	2,4…8,7 (3,7 ± 0,9)	2,3…7,1 (3,6 ± 0,8)	2,7…5,1 (3,7 ± 0,9)	2,8…6,2 (3,7 ± 0,6)

Протокол №1 22иЮн2015                                          Оператор: Скикеенч О-В.

SND3V213

G.rostochiensis

Пробирка	Образец	Результат	Специфика	ПК	■ Смецкфикв ......... вк
1/1	к+	+	12,50	1.74
2/1	к-	-	0,87	9,67
3/1	1OQX97	*	13,.10	1,15	=
4/1	I00S98		9.14	6.83
5/1	100903	+	12,90	I.M	—
6'1	фон	фон	1,01	1,00
7/1	фок          1     фон		0.99	1,00

Wqpw4i/x»arMte<’ точения                                          J00.00*         84,00* о                          jo

Примечание: l/l • положительный контрольный образец

2/1 • сиринательный контрольный обратки

3/1 ...5/1 - исследуемые обратны

6'1 .,.7/1 - фоновые обратим

Ин1ф1трмт;шкя результатов:

+ - обнаружена ДНК тесел сеемого пидд

• - - ие обнаружена ДНК исследуемого вк.та

Рис. 2. Результаты Flash-ПЦР-анализа нематоды к G. rostochiensis. В почвенных пробах с единичным обнаружением цист для подтверждения принадлежности цистообразующей нематоды к виду G. rostochiensis был проведен ПЦР-Flash-анализ, интерпретация результатов которого осуществлена по критериям, указанным на рис. 2. Согласно полученным данным, во всех проанализированных образцах обнаружена ДНК вида G. rostochiensis.

Таким образом, на территории Республики Карелия G. rostochiensis встречается повсеместно. Наибольшее распространение фитогель- минта зарегистрировано в почвах центральной и южной зон республики. При этом только часть обследованных площадей Олонецкого, Прионежского и Сортавальского районов свободны от глободероза. В отличие от сельскохозяйственных предприятий и КФХ почвы ЛПХ наиболее заражены нематодой, особенно в Кондопожском, Сегежском, Суоярвском районах. По морфометрическим признакам и данным ПЦР-Flash-анализа выделенные цисты относятся к виду цистообразующих нематод G. ros-tochiensis.