Распространение микроорганизмов в верхних слоях подземной биосферы в щелочных гидротермах Баргузинской долины

Подземная биосфера представлена геологически разделенными друг от друга экосистемами, различающимся по физико-химическим, геологическим и трофическим характеристикам (Всеволжский, 1991). В формировании химического состава и свойств подземной воды активно участвуют микроорганизмы. Исследования последних лет сформировали общую картину функционирования подземной биосферы: ограниченные источники энергии, лимитированное количество акцепторов и доноров электронов, нехватка микробиологически разлагаемых органических источников углерода (Phelps et al. 1989, Pedersen, 1993, Takai et al. 2001, Onstott et al., 2009; Wanger et al. 2006, Biddle et al., 2006, Huber et al., 2007, Schrenk et al., 2010). В последнее время начаты исследования функционального разнообразия микробных сообществ в верхних зонах подземной сферы щелочных минеральных источников (Намсараев и др. 2006, Brazelton et al., 2010, Tiago, Verissimo, 2012). Эта транзитная зона смешения подземных и поверхностных вод в системе щелочных и слабоминерализованных вод считается своеобразными «окнами» в подземную гидросферу (Sleep et al., 2004). В настоящее время эти исследования находятся на начальном этапе, и открывает широкие возможности получения новых знаний о прокариотной жизни.

Цель исследования: изучить распространение микроорганизмов в зоне смешения поверхностных и подземных вод гидротерм Кучигер и Умхэй.

Объекты и методы исследования

В период с 2015 по 2017 г. были исследованы горячие источники Умхэй и Ку-чигер (Баргузинская долина, Республика Бурятия). Физико-химические параметры воды и донных осадков определены в зоне смешения подземных и поверхностных вод в гидротермах Кучигер: Ku-1 (выход горячих вод вблизи грязевой ванны) и Ku-2 (котлован с выходами горячих вод). На минеральных источниках Умхэй — на станциях Um-1 (каптированный выход минеральных вод), Um-2 (некаптированный выход с микробными обрастаниями) и Um-3 (небольшое газирующее термальное озеро).

Микроэлементный состав воды определен в Геологическом институте СО РАН (г. Улан-Удэ), на масс-спектрометре с индуктивной связанной плазмой высокого разрешения ICP-MS Element XR (Thermo Scientific Fisher, Германия).

Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости у изученных культур проводили по методу Эрлангера с соавт. (Erlanger et.al., 1961), используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз — трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных, цистеиновых и амино- пептидаз (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA, GlpFApNA и TpNA, ApNA, LpNA, соответственно) и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ в диапазоне рН 5-12 использовали цитрат-фосфатный, фосфатный и гидрокарбонатный буфер. Температурный оптимум ферментов определяли после 5-минутной инкубации при температурах от 23–800С.

Результаты и их обсуждение

За период исследований температурный режим в донных осадках термальных источников оставался достаточно стабильным, 35,9–40,4 °С в поверхностных слоях источника Кучигер, 35,6–43 °С — в термальном озере Умхэй (таблица 1). Послойное измерение температуры выявило увеличение данного параметра с углублением, так в термальных грязях Кучигера на глубине 60 см в разные годы температура достигала 45–47 °С. В осадках термального озера Умхэй температура также повышалась до 40,4–47 °С в нижних слоях на глубине 12 см. Ниже 12 см начинались твердые горные породы. Исследуемые местообитания характеризуются восстановленными условиями, окислительно-восстановительный потенциал был в пределах — 35 — -400 Мв. Реакция среды была щелочная (рН 9,610.1).

В воде и донных осадках термальных источников определен макро- и микро-элементный состав. Основным катионом в минеральных водах является натрий (до 148,6 мг/л — Умхэй, 183,4 мг/л — Кучигер). Среди анионов в водах источника Умхэй преобладали НСО 3 ^- (73,22 мг/л) и SO 4 ^-2 (55,9 мг/л), в водах источника Кучигер эти же анионы, только в обратном порядке SO 4 ^-2 (74,8 мг/л) и НСО 3 ^-(51,87 мг/л). Общая минерализация в исследуемых источниках составляла 0,3 — 0,5 г/л.

Таблица 1

Физико-химические параметры в исследуемых источниках, 2016 г.

Источник	Донные осадки		Вода
	слой, см	t оС	t оС	рН	М, г/л	Еh, Мв
Кучигер, станция Ku — 1	-	-	38,2	9,8	0,37	-35
Кучигер, станция Ku — 2	0 — 10	42,8	40,9	9,7	0,32	-50
	20	42,4
	30	42,9
	45	43,9
	50	44,2
	60	45
Умхэй, станция Um-1	-	-	47,9	9,6	0,3	- 400
Умхэй, станция Um-2	-	-	40,6	9,5	0,15	- 305
Умхэй, станция Um-3	0-5	43	43		0,32	- 324
	5-6	45,8
	12	47

М — минерализация — осадки не отбирались

В балансе микроэлементов донных осадков гидротерм Кучигер и Умхэй обнаружен высокий процент содержания литофильных элементов (88,7–97,5%) при низких процентах элементов халькофильной (2,2–10,5%) и сидерофильной (0,3– 0,9%) групп. Послойный обзор элементов по данной классификации, показал, что с увеличением глубины в осадках источника Кучигер содержание элементов литофильной группы незначительно повышается. В осадках термального озера Ум-хэй соотношение этих групп по слоям практически не изменяется. В воде исследуемых гидротерм также отмечен высокий процент литофильной группы элементов (81,1–94,4%). Сравнительный анализ обоих источников показал, что в источнике Кучигер содержание халькофильной группы выше (16,4% — вода; 7,9–10,5% — осадки), чем в источнике Умхэй (3,1% — вода; 2,3% — осадки). Поскольку халькофильная группа по классификации Гольдшмидта — это химические элементы сульфидных руд, то, вероятно их количество связано с высокой концентрацией серы в источнике Кучигер — от 15,7 мг/кг до 17,5 мг/кг. В источнике Умхэй содержание серы не превышало 0,8 мг/кг.

Выделение в накопительные и чистые культуры микроорганизмов ключевых функциональных групп (гидролитиков, хемолитотрофов, сульфатре-дукторов), их описание, выявление физиолого-биохимических свойств и определение активности термо- и алкалистабильных ферментов.

На первых этапах разложения органического вещества минеральных источников активное участие принимают гидролитические бактерии, которые разрушают биополимеры. Аэробные и анаэробные протеолитические и целлюлозолитические бактерии обнаружены во всех слоях исследуемых проб. Их количество варьировало в зависимости от глубины залегания донных отложений. Максимальная численность аэробных протеолитиков составляла 104 кл/см3 и приходилась на верхние слои иловых осадков (до 4 см), а анаэробных — 103 кл/см3 (нижние слои до 16 см). Численность анаэробных целлюлолитиков достигала 102-103 кл/см3, аэробных — 10-102 кл/см3. Высокие численности сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), способные расти на лактате, и на ацетате (107 и 108 кл/см3), выявлены в донных осадках гидротермы Кучигер. В источнике Умхэй на станция Um-3 показано, что численность в верхних слоях донных осадков составляет 102103 кл/см3. Характерно, что к в горизонте 2–4 см численность возрастает до 104 кл/см3, но к горизонту 4–8 см она снова убывает. Максимальная численность обнаружена на горизонте 8–12 см убывая к нижним слоям. Из донных отложений источника Умхэй, были получены накопительные культуры сульфатредуцирую-щих бактерий. Культуры СРБ морфологически разнообразны и представляют прямые тонкие палочки, тонкие изогнутые палочки, вибрионы. Клетки, как правило, одиночные, редко сцепленные между собой по 2–4 клетки, некоторые вибрионы имеют жгутики. Морфологическая характеристика накопительных культур и выделенных бактерий-деструкторов показало их большое разнообразие. Физиологические группы сапрофитов и протеолитиков были представлены палочками и кокками. Некоторые палочковидные бактерии родов Bacillus sp. и Pseudomonas sp. обладали подвижностью. Были обнаружены как Грам– . так и Грам+ бактерии. Эти выделенные бактерии образовывали пигментированные или белые и бесцветные колонии. Целлюлозоразлагающие бактерии представлены палочковидными бактериями Clostridium sp. и Cellvibrio sp. Среди СРБ домини- ровали Грам– бактерии, представленные вибрионами (Desulfovibrio sp.), также обнаружены споровые палочковидные Грам+ бактерии (возможно, Desulfotomaculum sp.).

Из проб термальных источников Кучигер и Умхэй получены накопительные культуры гидролитических бактерий на среде Пфеннига, с добавлением 1% пептона и целлюлозы.

В накопительных культурах гидролитических бактерий, выделенных из донных осадков и воды термальных источников Умхэй и Кучигер проведен биохимический анализ стандартным методом Эрлангера (Erlanger et al., 1961). Результаты показали, что в колонке ила в источнике Кучигер обнаружена наиболее высокая общая протеолитическая активность на азоказеине и достигала 0,959 ед./см3, в колонке ила источника Умхэй активность составила 0,543 ед./см3. Высокое содержание органического азота в донных осадках, вероятно, обуславливает и активное развитие протеолитических бактерий с высокой ферментативной активностью.

Из накопительной культуры термального источника Умхэй, путем многократных пересевов была выделена чистая культура Um-14-2. Анализ гена 16S рРНК штамма показал, что он относится к семейству Thermaceae филума Deinococcus-Thermus , и являются представителем рода Меiothermus . По результатам BLAST-анализа наиболее близким к исследуемому штамму оказался вид Meiothermus ruber strain 16105 (Y13596.1). Уровень сходства составил 100% (Будагаева, Бар-хутова, 2015).

Присутствие органотрофных бактерий в транзитной зоне смешения подземных и поверхностных вод в системе щелочных и слабоминерализованных вод термальных источников Кучигер и Умхэй вполне объяснимо, поскольку эти микроорганизмы способны осуществлять первую стадию разложения многих органических полимеров до низкомолекулярных соединений и водорода, которые далее используются сообществом СРБ (Пименов и др. 2012).

Бактерия Meiothermus ruber , выделенная из источника Умхей была изучена на способность секретировать внеклеточные протеолитические ферменты. В качестве субстрата использовали различные пара -нитроанилиды 4-х групп пептидаз — трипсин-подобные, химотрипсин-подобные, субтилизин-подобные и цистеиновые (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA и GlpFApNA, соответственно) и белковый субстрат азоказеин. Одним из наиболее важных факторов, определяющих активность внеклеточных ферментов, является наличие в питательной среде оптимального субстрата (Дунаевский и др., 1995). У бактерии Meiothermus ruber была изучена динамика синтеза внеклеточных пептидаз в процессе культивирования на различных источниках азота. Показано, что наибольшая активность отмечена на синтетических субстратах, специфичных для субтилизин-подобных (GlpAALpNa) пептидаз и аминопептидаз (L-pNa, P-pNa). Характерно, что Mei-othermus ruber не гидролизовала субстраты, специфичные для трипсин-подобных, химотрипсин-подобных и цистеиновых пептидаз.

Показано, что в процессе роста культур активность внеклеточных ферментов зависит от наличия в питательной среде оптимального субстрата. Так, нами проведено сравнительное изучение синтеза внеклеточных пептидаз в зависимости от различных источников азота (соетон, пептон, глюкоза), а также времени культивирования (до 12 суток) на внеклеточную протеолитическую активность.

Исследования показали, что максимум секретируемой активности по субстрату GlpAALpNa для штамма Um-14-2 достигался на среде с пептоном соетоном и приходился на 2 и 10 сутки культивирования, соответственно.

Пептидазы штамма Um-14-2 имели оптимум активности при рН 8,0 и стабильность в широком диапазоне рН от 4,78 до 11,82.

Поскольку, выделенный штамм по экофизиологическим характеристикам отнесен к термофилам, определение температурного оптимума активности и стабильности ферментов проведены в диапазоне 23-80°С. Показано, что внеклеточные пептидазы штамма Um-14-2 имел оптимум активности при 50°С и стабильность в диапазоне от 23 до 60°С. Определение температурного оптимума и стабильности показало, что выделенный штамм имеет способность функционировать при высоких значениях температуры.

Определение природы функциональных групп активного центра показал, что активность внеклеточных пептидаз по субстрату GlpAALpNA у штамма Um-14-2 на среде с соетоном подавляется на 53,2% специфическим ингибитором сериновых пептидаз — фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ). Ингибиторы цистеиновых пептидаз — йодацетамид (ЙАА) и металлопептидаз — этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) совсем не оказывали влияния на активность.

Таким образом, субстратная специфичность и совокупность результатов ингибиторного анализа свидетельствуют о присутствии в культуре исследованного штамма внеклеточных сериновых пептидаз субтилизин-подобного типа.

Работа поддержана бюджетной темой ИОЭБ СО РАН АААА-А17-117011810034-9