Размножение Larix sibirica Ledeb. в культуре in vitro через соматический эмбриогенез и влияние микоризы на их рост в почве

Леса Монголии занимают переходную полосу между горно-таежными лесами Сибири и пустынями Центральной Азии и сосредоточены главным образом в горных районах на севере и западе страны. Это лесные массивы по северным склонам Хангая и Хэнтэя. С точки зрения вида и видового состава древесные растения в стране составляют лиственница — 78,7%, кедр — 9,3%, береза — 6,1%, сосна — 5,0%, ель — 0,23%, пихта — 0,02%, тополь — 0,2%, осина — 0,05%, вяз — 0,01%, ива — 0,28% и саксаул — 0,15%¹. Лиственница сибирская ( Larix sibirica Ledeb.) — один из наиболее распространенных и важнейших лесообразующих видов рода Larix . В мире насчитывается более 20 видов лиственницы, а в Монголии произрастают три вида лиственницы: Larix sibirica Ledeb, Larix sukaczewii и Larix gmelinii . Это самые распространенные деревья в лесу, занимающие более 70% [Дугаржав Ч., 2006]. Лесная экосистема страны сильно пострадала от деятельности человека, технологии лесозаготовок. В дополнение к вышеперечисленным факторам это зависит от биологических характеристик дерева, климатических условий, засухи, а также воздействия болезней и вредителей [Цогт З., 2012, Доржсурэн Ч., 2009]. Например, когда семена лиственницы прорастают, корневая шейка высыхает, основной стебель разлагается и 60–70% семян лиственницы становятся недееспособными из-за грибковых заболеваний и насекомых.

Соматический эмбриогенез является перспективным направлением в создании сортового плантационного лесовыращивания. В Монголии был разработан зиготический эмбриогенез Larix sibirica Ledeb у лиственницы сибирской в 2015 г. [Даваажаргал М., 2015]. Размножение larix sibirica ledeb. в культуре in vitro через соматический эмбриогенез и влияние микоризы на их рост в почвенной среде изучено недостаточно. При микроклональном размножении наблюдаются большие потери растений на этапе пересадки в другие условия. Приживаемость к новым условиям зависит от субстрата. Установлено, что для пробирочных растений необходим субстрат объемом пор 25% [Kim, 1988]. Большую роль в приживаемости растений к новым почвенным условиям играет его фитосанитарное состояние. Обогащение субстрата микоризой увеличивало приживаемость и рост растений [Чекурова Г. В., 1990]. Таким образом, растения, которые высаживают в другую почву, должны адаптироваться к новым условиям.

Объекты и методы исследования

В качестве материала для исследований использовались семена, собранные в 2017 г. с Биндер сум Хэнтийского аймака. Координаты GPS: N 48⁰20'54,9 " ; E 108⁰40'07,0, высота над уровнем моря 1578 м. Собранные семена имели ширину — 1,5–1,7 мм, длину — 3,5–5 мм, от темно-коричневого до желтоватого цвета. Очищенные семена замачивают в дистиллированной воде в течение 24 часов, обрабатывают раствором 70%-ным этанолом в течение 1 минуты. Затем семена стерилизовали в течение 15 минут раствором, содержащим 2,5% гипохлорита натрия (NaOCI), и тщательно промыли дистиллированной водой.

Питательная среда готовится заранее. Готовят базовую среду, включающую микро- и макроэлементы, витамины, железо, органические вещества в заданном количественном содержании компонентов в соответствующей модификации состава среды по MSGM. В качестве регуляторов роста использовали 1 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) и 2 мг/л 6-БАП (6-бензиламиноперемедин). Водородный показатель среды доводили до 5,8 перед автоклавированием. Проводится автоклавирование при 121ºС, 110 кРа в течение 20 минут. В полученную среду вводят экспланты зародышей семян. В каждой чашке Петри культивируют по 5 зародышей на 20 мл индукционной среды в темноте при 25 ± 2°С.

Микоризный субстрат для увеличения приживаемости и роста растений. Культивируемые in vitro микроклональные лиственницы сибирской пересаживают в горшок с субстратом, а на корни наносят препараты микоризы, сделанные в Словакии (Symbiom). Они были использованы в исследовании и включали следующие компоненты. Эктомикориза: Amanita rubescens, Hebeloma velutipes, Paxillus involutus, Coenococcum geophilum Эндомикориза: Claroideoglomus etunicatum Claroideoglomus claroideum Rhizophagus irregularis Funneliformis geosporum Funneliformis mosseae. Дозировка для приготовления микоризы в соответствии с инструкциями производителя: эктомикориза и эндомикориза по 3,25 мл с добавлением 15 мл воды. Почву просеивали через мелкое сито и стерилизовали в автоклаве в течение 20 минут, после чего стерилизованную почву помещали в столбчатый контейнер с микоризой. 35-дневные микроклональные лиственницы сибирской пересаживали в микоризную почву. Растения поливали 10 мл воды и регулярно опрыскивали, чтобы увлажнить их. В качестве контроля использовали микроклональные лиственницы сибирской, выращенные в почвах без микоризы.

Результаты исследований

В течение 14 дней пересаженные 5 эмбрионов в один контейнер зародыши прорастают через 2–4 дня (рис. 1А). Через 7 дней образуются почки и первичные корни (рис. 1Б). Однако 35-дневные микроклональные лиственницы морфологически сходны с лиственницей из семян и готовы к пересадке в почву (рис. 1В, 1Г). Тем не менее растения in vitro , особенно лиственничные микроклональные растения, имеют недостаток, заключающийся в невозможности адаптации непосредственно к внешней среде. Внешне эти растения тонкие и не закрываются края листьев, поэтому их необходимо адаптировать. Мы наполовину открыли крышку чашки Петра на 5–7 дней, накрыв пластиковым пакетом, и постепенно адаптировали к внешней среде. Перед тем как посадить в почву, корни микроклональной лиственницы промывали теплой водой, удалив питательную среду. Очищенные от питательной химической среды растения посадили в почву. В течение первой недели накрывали растения пластиковыми пакетами, чтобы предотвратить потерю влаги, и постепенно адаптировали микрорастения к внешней среде. Затем их пересаживали в почву с микоризой (рис. 1Д). Наблюдая за стадией микроклональной лиственницы сибирской, мы можем сделать вывод, что для получения лиственницы из зародышей семян требуется около 30–40 дней.

В результате у микроклональных растений, выращенных в почве без микоризы, корни не были заражены микоризой. Из основных корней растения не возникало разветвленных боковых корней (Рис 2А). Средний рост 15 растений составил 3,3 см, а средняя длина основного стебля — 4,3 см. Однако у микроклональных растений, которые были заражены микоризой, боковые корни образовывались из основных корней растений и среднее число разветвленных корней у 15 растений составляло 8,8 (табл. 1).

Рис. 1. А. Эмбриогенез, Б. Семидневный зародыш,

В. Микроклональное растение после 35 дней Г. 35-дневное микроклональное растение с главным корнем, Д. Растение, пересаженное в почву

Таблица 1

Рост инфицированных микоризой корней и растений

	Число разветвленных корней,ш	Длина разветвленных корней, см	Рост растений, см	Длина главного корня, см
Без микоризы	0	0	3,3±0,4	4,3±1,3
С микоризой	8,8±4,5	2,0±0,6	4,4±0,8	6,7±1,2

Кроме того, средняя длина разветвленных корней составляла 2 см, а средний рост растений — 4,4 см, что на 1 см выше, чем у растений, которые не были заражены микоризой, тогда как средняя длина основного корня была на 6,7 см и на 3,4 см больше, чем у растений, которые не были заражены микоризой (Рис 2Б). Микоризообразование на рис. 2В показывает, что гриб обволок корни растений.

Рис. 2. Корень лиственницы А. без микоризы. Б. с микоризой В. микоризообразование

Из этого можно сделать вывод, что заражение микоризой микроклональной лиственницы усиливает рост верхней части лиственницы и рост корней.

Коэффициент выживаемости деревьев, зараженных микоризой, определяли путем сравнения количества живых деревьев с общим количеством деревьев, выраженным как 100%.

На рис. 3 процент выживаемости микроклональных растений после сто два-цати дней составляет 64, процент выживаемости контроля составляло 42 после шестидесяти дней. Приживаемость к новым условиям контроля после шестидесятидневного роста показала неспособность выжить.

Рис. 3. Коэффициент выживаемости микроклональной растений

Обсуждение

И. Н. Третьякова, А. В. Барсукова [2012] использовали комбинацию БАП и гормонов 2.4-D в питательной среде MSGm для образования почек каллуса in vitro путем соматического эмбриогенеза из зародышей зигот лиственницы Larix sibirica, L. gmelinii и L. sukaczewii . Из зародышей трех видов лиственницы образовались 50–81% каллуса из L. gmelinii , 53–93% лиственницы Larix sibirica и 98% лиственницы L. sukaczewii . В исследовании мы опирались на работу Цэрэндэ-жид Л., Энхчимэг В. [2019], которые объединили гормоны MSGm 2.4-D и BAP in vitro , чтобы сформировать почки из эмбриона. В Монголии использование микоризы после культуры in vitro на Larix sibirica изучено мало. Исследования Pinus sylvestris в теплицах показали, что высота проростков, диаметр шейки и длина корня определяются тем фактом, что эктомикориза ускоряет рост проростков [Ган-туяа Б., Бүрэнжаргал О., 2019]. P.D. Khasa и другие [2001] изучили на проростке Larix sibirica шесть видов эктомикоризных грибов. Для лучшего роста сеянцев и улучшения качества окружающей среды снизили уровень удобрений в питомниках до 33%, используя отобранные микоризные грибы. Колонизация эктомикоризы во всех проростках не зависела от уровня удобрений. Растения формировали хорошо развитую эктомикоризу. В наших исследованиях микроклональные проростки Larix sibirica Ledeb всходят с 9 видами микориз, что привело к росту корней на 6.7 см больше, чем без микоризного контроля. Таким образом мы видим, что микоризы увеличивают количество поглощаемой воды и питательных веществ у корня растения и создают связь между корнями и почвой, разветвляя корни растений на более широкой территории (Gerdemann, 1974).

Заключение

Таким образом было определено, что для получения микроклональной лиственницы сибирской эффективно использовать в качестве регуляторов роста 1 мг/л

2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) и 2 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопе-ремедин). У микроклональных растений, которые были заражены микоризой, боковые корни образовывались из основных корней растений и среднее число разветвленных корней у 15 растений составляло 8,8 см. Средняя длина основного корня была на 6,7 и 3,4 см больше, чем у растений, которые не были заражены микоризой. Исходя из этого видно, как микоризы увеличивают у растения корни, которые разветвляются на более широкой территории.

Авторы выражают огромную признательность и благодарность германской государственной компании (GIZ) за оказанную помощь в проведении данного исследования.