Разнообразие бактерий, выделенных из района разработок месторождения калийных солей Верхнекамья

• ^aИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

• ^bПермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Из почвы, воды и галитовых отходов района солеразработок (г. Соликамск, Пермский край) методом накопительных культур выделено 12 различных по грампринадлежности штаммов бактерий. По результатам генотипирования методами REP-ПЦР и ARDRA выделенные штаммы были объединены в пять различных геномогрупп. У представителей геномогрупп определены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК, сравнительный анализ которых показал принадлежность штаммов к родам Bacillus, Virgibacillus , Pseudomonas, Chromohalobacter и Idiomarina . Из образца породы калийно-магниевых солей выделены два штамма, идентифицированные как представители родов Bacillus и Streptomyces. В накопительной культуре из данного образца на полноценной среде c 20% NaCl обнаружены бактерии, близкородственные бактериям родов Ralstonia и Stenotrophomonas (сходство 98%) . Большинство выделенных штаммов растет при 15-20% NaCl в среде культивирования, штаммы С2 и К52 способны к росту в щелочных условиях (pH 9.0). Штамм Pseudomonas sp. К513 использует в качестве субстрата бензойную кислоту в высокой концентрации (5 г/л) при содержании в среде культивирования 3% хлорида натрия.

В последние десятилетия интенсивное исследование микрофлоры экосистем с высоким засолением среды позволило выделить и охарактеризовать умеренно и экстремально галофильные бактерии, различные по систематическому положению и отличающиеся разнообразием ферментных систем (Ventosa et al., 1998). Данные бактерии представляют интерес в связи с высоким биотехнологическим потенциалом, в частности они могут быть использованы для получения осмопротектерных соединений, ферментов, активных при высоком осмотическом давлении среды, а также для создания биопрепаратов очистки почв и стоков со сложным, полихимическим характером загрязнения (Margesin, Schinner, 2001).

Цель работы – исследование разнообразия микроорганизмов почвы, воды, образца породы и галитовых отходов района солеразработок.

Методы исследования

Образцы почвы, воды, галитовых отходов, а также образец породы для постановки накопительных культур были отобраны на территории Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей (ОАО ”Сильвинит” г. Соликамск). Отбор образца почвы производился на глубине 5 см на расстоянии 2 м от солеотвала в осеннее время года. Проба воды была взята из прилегающего к солеотвалу водоема с глубины 5 см от поверхности и на расстоянии 70 см от береговой линии. Образец галитовых отходов отобран с глубины 5 см непосредственно с солеотвала.

Метод накопительного культивирования

Для выделения штаммов микроорганизмов использовали метод накопительного культивирования. Для постановки накопительных культур (НК) использовалась жидкая минеральная среда Раймонда (Розанова, Назина, 1982) с разными концентрациями NaCl (5, 10, 15, 20, 25%). В качестве субстратов использовались: бензоат (1 г/л) или триптон (0.5 г/л) и дрожжевой экстракт (0.25 г). Образцы почвы, воды или галитовых отходов (1 г) были помещены в 250 мл колбы с 100 мл ростовой среды. Инкубация проводилась в течение 2 недель на термокачалке (100 об/мин.) при температуре 28оС. Из накопительных культур путем высева на селективные агаризованные среды выделяли чистые культуры микроорганизмов. Чистота культур контролировалась путем высева на агаризованную полноценную среду Раймонда, содержащую 3% хлорида натрия.

Изучение физиологических свойств

Устойчивость бактерий к NaCl (концентрация соли от 3 до 25%) определяли на полноценной агаризованной среде Раймонда. Рост бактерий учитывали на седьмой день.

Рост бактерий при разных значениях рН определяли при концентрации Na+ 0.8-0.85 М в буферных системах (для рН 5 - ацетатный буфер, для рН 6-8 - фосфатный буфер, для рН 810 - трис-HCl буфер (“Методы общей бактериологии”, 1983), приготовленных на основе минеральной среды Раймонда, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и энергии. Штаммы культивировались на агаризованной среде при рН 5, 7, 8, 9, 10. Рост учитывали на седьмой день.

Идентификация бактерий

Идентификацию бактерий проводили на основе изучения их культуральных, морфологических и биохимических свойств (Определитель бактерий Берджи, 1997; Методы общей бактериологии, 1983). Морфологию и жизненный цикл бактерий изучали у выращенных на агаризованной среде 12-72часовых культур с использованием световой микроскопии (фазовый контраст).

Амплификация гена 16S рРНК. Для амплификации использовали бактериальные праймеры 27F и 1492R. Амплификацию проводили так, как описано у Гавриш и др. (2004).

REP-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся экстрагенетических палиндром-ных последовательностей ДНК) проводили по методу Versalovic (1994). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5% агарозном геле, приготовленном на 1 х ТВЕ буфере (Маниатис и др., 1984).

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции. 5 мкл ПЦР продукта были обработаны 1 ед. рестрикционных ферментов Hha I и Mse I (Fermentas, Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим. Фрагменты рестрикции разделяли электрофорезом в 1.2% агарозном геле (Scortichini et al., 2002).

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез ампликонов 16S рРНК был выполнен в 6% (в/об.) полиакриламидном геле, содержащем линейный денатурирующий химический градиент от 35 до 50%, где 100% составляет 7М мочевина и 40% - формамид, согласно протоколу Muyzer et al. (1993).

Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Секвенирование гена 16S рРНК, амплифицированного с использованием универсальных бактериальных праймеров (Гавриш и др., 2004), проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 (JSC GE “Healthcare”, США).

Филогенетический анализ .

Нуклеотидную последовательность 16S рДНК изучаемого изолята сравнивали с нуклеотидными последовательностями типовых штаммов близкородственных видов из базы данных GenBank с помощью программы CLUSTAL W и корректировали вручную (Thompson et al., 1994). Эволюционное расстояние, выраженное как число замен на 100 нуклеотидов, рассчитывали согласно методу Jukes, Cantor (1969). Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON c использованием метода “neighbor-joining” (NEIGHBOR) (Van de Peer, DeWachter, 1994). Оценку статистической достоверности ветвления (“bootstrap-анализ”) проводили с использованием соответствующей функции программы TREECON на основе 1000 альтернативных деревьев.

Результаты и обсуждение

Из образцов почвы, воды и галитовых отходов района солеразработок ОАО “Сильвинит” (г. Соликамск, Пермский край) методом накопительного культивирования (НК) на полноценной и минеральной среде Раймонда с разным содержанием NaCl были выделены 14 штаммов бактерий, различных по грампринадлежности, морфологии клеток и колоний.

Из НК на полноценной среде с содержанием NaCl 5 %, 10 и 15% выделено два грамположительных (С32, С41) и шесть грамотрицательных (В151, В152, В153, В154, В201, В202) штаммов бактерий. Выделенные штаммы обладают каталазной активностью, оксидазоотрицательны. Из НК на минеральной среде с бензоатом в качестве субстрата и содержанием NaCl 5% выделено четыре бактериальных штамма (К51, К52, К511 и К513), различных по грампринадлежности, каталазной и оксидазной активностям.

Проведено сравнение выделенных штаммов с использованием методов REP-ПЦР и ARDRA. Анализ полученных REP-ПЦР профилей фрагментов геномной ДНК исследуемых штаммов показал, что два штамма - К511 и К513 входят в одну геномогруппу (I тип) (рис. 1). Штаммы В201 и В202 также составляют одну геномогруппу (II тип). Штамм В153 отличается от представителей данных групп и выделен в отдельную геномогруппу (III тип).

м 1 2 3 4 5

м 1 2 3 4 5   6 7 8 1 2 3 4 5    6 7 8

IV V I II         III IV V I II III

I III II

А

Mbo I              Hha I

B

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации REP-ПЦР штаммов-деструкторов (A) и 16S рДНК, обработанных рестриктазами Mbo I и Hha I (B). На электрофореграмма А: м - маркер 1 kb (“Силекс”, Россия), 1 - К511, 2 - К513, 3 - В153, 4 - В201, 5 - В202. На электрофореграмма В: м - маркер 1 kb (“Силекс”, Россия), 1 - В151, 2 - В152, 3 - К513, 4 - К511, 5 - В201, 6 - Paenibacillus sp. SN501, 7 - Bacillus sp. 2508, 8 - В153.

0.02

I----------------------------------1

I B. sabtilis subsp. suhriiis DSM10¹ (AJ2 76351)

B. mojavensis IFO15718¹ (AB021191)

B. subtilis subsp. spiziaeui NRRLB-23049^T(AFD749 7D)i

50 I B. vaiiismortis DSM11031¹

B. omrZati_y!Me/aciezisATCC23350^T(X60605)

B. atrophaeus JCM9070¹ (ABO21181)

B. soHorensis NRRL B-23154¹ (EU138473)

В. lichMformis DSM13¹ (X68416)

63 -C2

B. as^us 24 K^T fAJ831843^

B. tequileKsis 10b¹ (AY197613)

98J B. pumiius DSMZ27¹ (AY456263)

¹ B. safensis FO-OMb¹ (AF234854)

B. uhtotdims 41KF2b^T (AJS31842)

B. aerophihisl'SK¹ (AJ831844)

B. stratosphericiis 41KF2a^T (AJ831841)

B. idrienss S MC 4352-2^T (AY904033)

100 I B. in&cus Sdtt¹ (AJ583158)

B. cibi JG-3O¹ (AY55O276)

----Б. taeanensis BH030017¹ (AY6039^)

В. «igicola KMM3 737¹ (AY22S462)

— В. hwajinpoensis SW-72¹ (AF541966) B. decoleradouis LMG 19507^T(AJ315075)

AlicydobacUlus addocaMarius NBRC 15б52^т (AB271754)

Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение штамма С2 в системе рода Bacillus . Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000 альтернативных деревьев

Результаты рестрикционного анализа амплифицированных 16S рДНК (ARDRA) с использованием рестриктаз Mbo I и Hha I подтвердили принадлежность штаммов К511 и К513 к одной геномогруппе (I тип). Штаммы В201, В153, В151 и В152 отличаются от представителей данной группы и различаются между собой. Они выделены в отдельные геномогруппы II, III, IV и V типа, соответственно (рис. 2).

У представителей геномогрупп были определены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК размером около 1400 п.н.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК показал 99.5% сходство штамма К51 с типовым штаммом вида Bacillus alсalophilus . Штамм К513 имеет наибольший уровень гомологии с типовым штаммом вида Pseudomonas putida (99%), штамм К52 - с типовым штаммом вида Virgibacillus picturae (99,5%), штаммы В201 и В151 – c Chromohalobacter canadensis (99.4%), штаммы B152 и В153 – с типовым штаммом вида Idiomarina loihensis (99.5%).

Из образца породы калийно-магниевых солей методом НК на полноценной среде Раймонда, содержащей 5% NaCl, выделено два штамма: С31 и С2. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма С2 выявил его принадлежность к роду Bacillus . Наибольшее сходство (100%) изолят С2 имеет с B. licheniformis DSM13^T

(X68416) (рис. 3). Штамм С31 имеет наибольший уровень гомологии с типовым штаммом вида Streptomyces ambofaciens (99.4%).

Грамположительные штаммы способны к росту как в отсутствие соли, так и при концентрации NaCl до 3%. Они являются галотолерантными микроорганизмами по классификации Кашнера (Кашнер, 1981). Грамотрицательные штаммы не растут в отсутствие соли в среде, способны расти при концентрации NaCl 10%–15%, а штамм В201 – до 20%. Данные штаммы относятся к галофильным микроорганизмам (таблица 1).

Все выделенные бактерии растут при значении рН 7.0, штаммы Bacillus sp. C2 и Virgibacillus sp. К52 являются алкалофильными и способны к росту в щелочных условиях среды - рН 9 (табл. 1). Способность спорообразующих бактерий к росту в условиях повышенной солености и высоких значений pH среды описана для ряда галоалкалофильнх штаммов рода Bacillus, выделенных из содовых озер и солончаков (Vargas et al., 2005; Sorokin et al., 2008).

Два штамма - Bacillus sp. К51 и Virgibacillus sp. К52 - способны к слабому росту на бензойной кислоте в среде, содержащей NaCl в концентрации до 4 %.

Грамотрицательный штамм Pseudomonas sp. К513 эффективно растет на бензоате (1 г/л) в среде без добавления соли и в среде, содержащей до 6% хлорида натрия.

Таблица 1

Рост штаммов бактерий в полноценной среде Раймонда при различных значениях рН среды и в присутствии различных концентраций хлорида натрия

Штамм	Концентрация NaCl (%)				Значение pH
	Без NaCl	3	15	20	6.0	7.0	8.0	9.0
Bacillus sp. C2	+	+	+		+	+	+	±
Streptomyces sp. C31	+	+			+	+	+
Chromohalobacter sp. B151		+				+
Idiomarina sp. B152		+				+
Idiomarina sp. B153		+	+			+
Chromohalobacter sp. B201		+	+	+		+
Chromohalobacter sp. B202		+	+			+
Pseudomonas sp. К511	+	+				+
Pseudomonas sp. К513	+	+				+
Bacillus sp. К51	+	+				+
Virgibacillus sp. К52	+	+			±	+	+	+

Примечание: “+” – хороший рост (колонии размером более 3 мм); “±” - средний рост (колонии размером 1-2 мм); “–“ - отсутствие роста бактерий.

Известна способность ряда грамотрицательных галофильных штаммов, в частности Halomonas campisalis и Chromohalobacter sp. HS-2, к утилизации бензоата в концентрации 1.6 г/л и 0.6 г/л соответственно (Kim et al., 2008; Oie et al., 2007). Выделенный нами штамм К513 растет на данном субстрате в высокой концентрации - до 5 г/л (рис. 3).

Рис. 3. Максимальное значение оптической плотности штамма К513 в минеральной среде Раймонда (3% NaCl) при разных концентрациях бензойной кислоты

I Uncultured bacterium

II « Ralstonia pickettii »

III « Stenotrophomonas maltophilia »

Рис. 4. ДГГЭ продуктов амплификации фрагмента гена 16S рРНК, полученных с матрицы суммарной бактериальной ДНК накопительной культуры, культивируемой на 20% NaCl ( 1 ); 2, 3, 4 – реамплифицированные элюаты

1    2    3    4

Из образца породы калийно-магниевых солей получена накопительная культура на полноценной среде Раймонда, содержащей 20% NaCl. В НК преобладали палочковидные прямые и искривленные клетки, одиночные, в парах и собранные в цепочки. Размер клеток варьировал от 0.4 х 0.9 мкм до 0.5 х 2.8 мкм. Однако при высеве на агаризованные среды с разным содержанием хлорида натрия (от 3% до 20%) бактериального роста не наблюдалось. Для дальнейшего исследования НК был использован метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (рис. 4).

У фрагментов 16S рДНК, отличающихся электрофоретической подвижностью и элюированных из агарозного геля, определены нуклеотидные последовательности. Показано, что в составе НК присутствуют бактерии разных классов, близкородственные бактериям рода Ralstonia (сходство с типовым штаммом Ralstonia pickettii HPC578^T 95%) и рода Stenotrophomonas (сходство с типовым штаммом Stenotrophomonas maltophilia PSM-1^T 99%).

Заключение

В исследуемых образцах почвы, воды и галитовых отходов района солеразработок обнаружены бактерии, отличающиеся по физиологическим характеристикам и таксономическому положению. Выделены бактерии класса Gammaproteobacteria (родов Pseudomonas, Chromohalobacter, Idiomarina, Stenotrophomonas), класса Betaproteobacteria (рода Ralstonia), класса Bacilli (родов Bacillus, Virgibacillus) и класса Actinobacteria (рода Streptomyces).      Исследуемые штаммы представлены                галофильными, галотолерантными и галоалкалофильными бактериями, ряд штаммов способен к деструкции бензоата при высокой солености среды. Изолированные штаммы бактерий являются перспективными для использования при биоремедиации почв и стоков с повышенным содержанием солей и решения ряда других биотехнологических задач.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №07-04-96078_а., ФЦП “Научные и научнопедагогические кадры инновационной России”, тема ”Разработка биокаталитических технологий синтеза органических кислот и энантиомерно-чистых соединений для полимерной химии, медицины и экологической биотехнологии на основе микроорганизмов-продуцентов, селекционированных из природных и антропогенно-измененных почв” ГК№02.740.11.0078.