Разработка альтернативных методов оценки токсичности химических соединений на организм с использованием культур клеток

Культуры клеток занимают все более заметное и важное место в токсикологических, фармакологических и других исследованиях. Создание новых лекарственных средств тесно связано с поиском новых биологически активных соединений, их разработкой и клиническими испытаниями. Согласно существующим требованиям каждое внедряемое химическое соединение должно получить токсико-гигиеническую оценку. При этом широкое использование новейших достижений в морфофункциональных исследованиях позволяет изучать изменения, вызванные действием малых (недействующих) доз различных веществ на животный организм, на уровне клеток и субклеточных структур.

Отсутствие клинических проявлений в раннем периоде первичных повреждений клеток и невозможность определения воздействия малых доз на организменном уровне заставляют уделять все большее внимание моделированию таких процессов, которые значительно облегчают, а иногда являются единственно возможным при использовании клеток, культивируемых вне организма (1).

В Европе для оценки токсичности препаратов in vitro активно используется во многих сферах биотехнологии наравне с клиническими испытаниями. Интеграция России в европейские экономические структуры, в частности, предполагаемое вступление ее в ВТО потребует принятия законодательных актов, аналогичных европейским, ограничивающих использование животных для токсикологических испытаний .

Альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных методы оценки токсичности химических соединений с использованием клеточных культур находят все более широкое применение. Они позволяют значительно уменьшить расход биологического материала и сократить сроки исследования. Еще одно преимущество in vitro моделей – возможность установления характера биологической активности на клеточном уровне и учет синергических разнонаправленных эффектов смесей химических соединений (2,3).

В альтернативных моделях, применяемых в токсикологии, важная роль отводится экспериментальным объектам с биологической организацией различных уровней сложности: изолированные органы, культуры клеток и др. (3).

Альтернативные способы тестирования лекарственных препаратов in vitro, основанные на применении различных биологических моделей, позволяют оценивать как специфическое действие ксенобиотика, так и определять его параметры в отношении определенных клеток-мишеней. Быстрота и хорошая воспроизводимость результатов, доступность, а также возможность существенно ограничить применение лабораторных животных в доклинических исследованиях делают альтернативные тесты основным инструментом в сборе предварительной информации (4,5).

В связи с вышеизложенным была поставлена следующая цель: изучить воздействие миорелаксанта М3 на рост перевиваемой линии клеток ЛЭК.

Условия, материалы и методы. В опытах in vitro была использована перевиваемая линия клеток ЛЭК(легкие эмбриона коровы).

Культивирование проводили монослойно в 24-луночных культуральных планшетах и 5 % СО2, при температуре 37°С на основе питательных сред Игла-МЕМ, 199 с добавление 10 % бычьей сыворотки. Перед использованием перевиваемые клетки размораживали и культивировали до нормализации ростовых свойств. В качестве контроля использовали флаконы с клеточной суспензией без внесения каких-либо веществ. Затем флаконы с культурами выдерживали в термостате в течение 24 и 72ч, в камере Горяева подсчитывали количество живых клеток. Для определения жизнеспособности клеток к 1 мл суспензии добавляли 1 мл 0,5 % водного раствора трипанового синего.

Клеточные линии поддерживали путем периодического пассирования в культуральных матрасах объемом 200…250 мл, пересевы были проведены по мере формирования монослоя, как правило, через 4…5 сут культивирования. Клетки снимали бесцентрифужным способом с использованием смеси растворов версена и трипсина в соотношении 1:3.

Влияние миорелаксанта «М 3 » на культурально – морфологические свойства клеток были определены подсчетом количества живых и мертвых клеток. Для определения цитотоксичности использовали водные растворы миорелаксанта «М 3 » в дозах 10; 5; 0,5 и 0,05 мг/мл.

Результаты и обсуждение. Результаты изучения влияния миорелаксанта «М 3 » путем внесения различных концентраций вещества в среду культивирования с последующим подсчетом количества живых и мертвых клеток показали, что миорелаксант «М₃» не оказывал влияния на размножение и рост культур клеток ЛЭК (таблица).

Определение цитотоксичности для миорелаксанта «Мз», мг/мл

Как видно из таблицы, миорелаксант «М3» в концентрациях 0,05; 0,5; 5,0; и 10,0 мг/мл не оказывал токсического действия на культуру клеток – в исследуемых мазках мертвые клетки не обнаруживались.

Выводы. В результате исследований установлено, что миорелаксант «М₃», в концентрациях 10; 5;0,5; 0,05 мг/мл не вызывал гибель клеток и не оказывал цитотоксического действия.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии)/ Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова – М.: Компания Спутник+. - 2000. – 400 с. 2. Еськов, А.П. Токсикологические испытания. Альтернативные методы. //Токсикологический вестник .- 2003.-№5.-С.25-29. 3. Информационный бюллетень ассоциации клеточных культур. С-Пб,1997.-№12. 4.

Плотникова, Э.М, Е.Ю. Хамзина, Ю.М.Кириллова, и др. Применение перевиваемых линий клеток для скрининга сильнодействующих ядовитых веществ и их антидотов/ Матер. Международной Научно-практ. конф. «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины». - Саратов: ГНУ СНИВИ РАСН./ИП Моисеева Е.В.-2011.-С.226-227. 5. Червонская Г.П. Культура клеток - биологическая модель в токсикологических исследованиях //Тезисы докладов 1съезда токсикологов России. - М.-1998.-С.328.

РАЗРАБОТКА АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОРГАНИЗМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Плотникова Э. М., Ларина Ю. В., Глаголева И. С., Фазлиахметов Р. Г. Резюме

Определено влияние различных доз миорелаксанта «М3» на перевиваемую линию клеток ЛЭК. Показано, что миорелаксант «М3» не оказывает отрицательного влияния на рост клеток в культуре.

DEVTLOPMENT OF ALTERNATIVE METODS OF THE ASSESSMENT TOXICOLOGICAL, IMPACTS ON THE ORGANISM WITH USE OF CELL CULTURES

Plotnikova E.M., Larina J.B., Glagoleva I.S., Fazliahmetov R.G. Summary

Was studied enfluense myorelaxant different doses M 3 on cultures cells LEK. M 3 did not influence on grown cell LEK in vitro.