Разработка белкового биочипа для определения маркеров воспаления в сыворотке крови

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), включая гриппозные инфекции, вызывают подавляющую часть всех зарегистрированных инфекционных заболеваний.На данный момент методы молекулярной диагностики группы респираторных заболеваний во многом ограничены.В связи с этим, данный проект направлен на разработку нового мультиплексного метода персонифицированной диагностики гриппоподобных заболеваний (ГПЗ) и тяжёлых острых респираторных инфекций (ТОРИ), который позволит определить соответствующие этиологические агенты,а также прогностические маркеры системной воспалительной реакции.

Цель. Разработка многопараметрического диагностического комплекса, включающего набор реагентов на основе белкового микрочипа, осуществляющего диагностику возбудителей тяжёлых острых респираторных инфекций с одновременным анализом молекулярных маркеров, характеризующих процесс протекания заболевания.

Материалы и методы. Принцип действия биочипа состоит в следующем.На химически модифицированную поверхность предметного стекла роботом для печати наносятся первые захватывающие антитела и производится их ковалентное связывание.Далее биочипы инкубируют с исследуемым биологическим образцом (мазком из носоглотки и/или сывороткой крови)пациента для определения в аналите уровня искомых биомаркеров. Захва- ченные белки затем детектируются вторыми выявляющими антителами, меченными био-тином.В конечном итоге производится детекция связавшихся вторых антител посредством стрептавидина, меченного флуорофором (Су5 или Су3), с помощью флуоресцентного скане-ра.По уровню интенсивности флуоресценции от аналита в сравнении со стандартом судят о концентрации биомаркеров в исследуемом образце.

В качестве патогенов, одновременно определяемых с помощью биочипа,были выбраны вирусы гриппа типа A и B, вирусы парагриппа II и III типа,аденовирус и респираторно-синцитиальный вирус, поскольку они имеют наибольшую эпидемиологическую значимость среди респираторных вирусов, вызывающих острые, тяжёлые и хронические заболевания. В качестве основных маркеров воспаления были выбраны: С-реактивный белок (CRP), липополисахарид-связывающий белок (LBP), интерлейкин IL-6, интерлейкин IL-8, интерлейкин IL-18. Поскольку повышение содержания уровня этих белков в клинических материалах может служить следствием осложнённого течения респираторных вирусных и бактериальных инфекций,то эти белки можно использовать в качестве прогностических биомаркеров начала воспалительного процесса.

Результаты . В ходе проведённых исследований был создан прототип универсального белкового микрочипа для определения целого спектра возбудителей респираторных инфекций человека, а также белковых маркеров воспаления для повышения прогностической значимости разрабатываемой тест-системы. В дальнейшем этот прототип будет апробирован на клинических образцах пациентов с ОРЗ (назофарингеальные мазки и образцы сыворотки крови)с подтверждением диагноза сертифицированными ОТ-ПЦР наборами для определения гриппа и ОРВИ.Выборка пациентов составит 100 человек.

Выводы. Разработанная тест-система может найти применение как в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений, так и в поликлинических центрах для быстрого подтверждения или опровержения диагноза заболевания, вызванного респираторными инфекциями на ранних и более поздних стадиях развития болезни.

ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XIV, № 4, 2018

Проект осуществляется при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, Соглашение № 14.604.21.0180, уникальный идентификационный номер проекта RFMEFI60417X0180.