Разработка и получение ДНК-иммуногена на основе генов SARS-СоV-2

Возбудителем COVID-19 является бета-коронавирус SARS-СоV-2, распознанный в качестве патогена посредством секвенирования метагеномной РНК и выделения вируса из образцов жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов с тяжелой пневмонией [10].

За последний год был достигнут огромный прогресс в создании эффективных вакцин против SARS-СоV-2. Согласно предварительному проекту ВОЗ по вакцинам, в настоящее время 172 вакцины-кандидата находятся в стадии доклинической разработки, 63 – в стадии клинической разработки, 6 из которых основаны на технологии плазмидной ДНК [1]. Эти вакцины могут легко производиться бактериями в больших количествах, их производство достаточно просто масштабируется и менее затратно по сравнению с иными вариантами вакцин [4].

На данный момент высказываются опасения по поводу безопасности и эффективности вакцин, разрабатываемых на основе различных технологических платформ. Важно, чтобы на введение вакцины не возникло аутоиммунной перекрестной реактивности за счет присутствия в активных агентах вакцины участков, гомологичных участкам генома человека [8]. Кроме того, предпочтительнее использование вакцин, которые также действенны против мутировавших штаммов нового коронавируса.

Разработанные на данный момент вакцины недостаточно эффективны от мутирующих штаммов, поскольку содержат в себе в том числе неконсервативные последовательности S белка [7]. Поэтому актуальна разработка ДНК-иммуногена, безопасного и активного против мутирующих штаммов SARS-СоV-2.

Цель работы – разработка и получение ДНК-иммуногена на основе плазмидной ДНК, кодирующей иммуногенные фрагменты структурных белков нового β-коронавируса SARS-СоV-2, вызывающего коронавирусную инфекцию 2019 (COVID-19).

Материалы и методы

Полноразмерная последовательность генома базового дикого типа SARS-СоV-2 была получена с сайта NCBI (NC_045512.2). Наиболее иммуногенные (клеточный иммунный ответ) фрагменты структурных белков M, S, N, E SARS-СоV-2 выбрали с помощью программы “СD4 T cell immunogenicity prediction” [2]. Участки белков, содержащие наибольшее количество иммуногенных фрагментов, объединили с помощью полиглициновых линкеров. Выровняли полученную последовательность с помощью BLAST против белков человека, чтобы убедиться в отсутствии сходства. Для экспрессии в эукариотических клетках к гибридной

Синтез гибридной последовательности с последующей вставкой в экспрессионный вектор рСМV-3Таg-3а был произведен на коммерческой основе в компании GenScript (США). Полученную плазмиду рСМV-3Таg-3а-СVVV3 нарабатывали в клетках E. coli DH5 . Подлинность плазмиды подтверждали методом ПЦР, рестрикцией по сайтам клонирования ВаmНI и ХhоI и секвенированием по Сэнгеру.

Выделение плазмидной ДНК из биомассы E. coli осуществляли методом щелочного лизиса. Осадок ДНК растворяли в воде и обрабатывали РНКазой А. Для последующей хроматографической очистки использовали последовательно анионообменную, гидрофобную и вновь анионообменную хроматографию.

Определение доли содержания суперспи-рализованных топоизомеров плазмидной ДНК производили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте натрия хлорида (Gen-Pak FAX, NP, AXC 4,6⋅100 мм 2,5 мкм, (Waters, США)). Отсутствие РНК проверяли по отсутствию диффузной полосы в области 200–500 пар нуклеотидов в 1% агарозном геле. Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводили с помощью ЛАЛ-теста (Pyrotell) согласно рекомендациям производителя. Определение содержания остаточных белков осуществляли методом твердофазного ИФА с помощью набора Cygnus E. coli Host Cell Proteins (Cygnus, № F410, США) согласно инструкции к набору.

Суммарные кроличьи антитела из сывороток крови получали двукратной иммунизацией с интервалом в 2 недели 6 самок кроликов породы Советская Шиншилла внутримышечно (в бедро) 2 мл следующей смеси: плазмидная ДНК – 0,2 мг/мл, полиэтиленимин – 1,2 мг/мл, Sabowax – 2%, глюкоза – 10%, бензиловый спирт – 0,3%. Выделение и очистку антител проводили высаждением насыщенным раствором сульфата аммония.

Наличие специфических антител к гибридному белку СVVV3 определяли с помощью Вестерн-блоттинга с использованием белка СVVV3 в качестве антигена (был наработан в культуре эукариотических клеток НЕК293) и антител, выделенных из сыворотки кроликов. Использовали поликлональные антитела Goat Anti-Rabbit IgG conjugate (HRP) (EMD Millipore Corp, USA), специфичные к линейным участкам белковой молекулы. Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы проявлялись с помощью тетраметилбензидина (TMB). Как отрицательный контроль была использована сыворотка кроликов до иммунизации.

Созданная конструкция (рисунок 1), представляет собой ДНК-иммуноген, кодирующий гибридный белок, состоящий из фрагментов основных белков M, S, N и Е коронавируса SARS-СоV-2. Химерный белок, экспрессирующийся в клетках млекопитающих, содержит 424 аминокислоты, имеет прогнозируемую массу 46,5 кДа и рI 9,61, является стабильным и его период полураспада у млекопитающих составляет около 100 часов [3].

В результате лизиса и хроматографической очистки из 1 кг биомассы получили 100 мг ДНК-иммуногена рСМV-3Таg-3а-СVVV3 в растворе с концентрацией 1 мг/мл.

Полученный образец проанализировали согласно ряду критериев, указанных в Государственной Фармакопее РФ (ОФС.1.7.1.0013.18

ДНК-вакцины). Время выхода суперспирализо-ванной изоформы плазмидной ДНК составило 6,26 минут, площадь пика 85,64% (рисунок 2).

Концентрация эндотоксинов в растворе 1 мг/мл составила менее 25,0 ЕЭ на 1 мл, концентрация остаточных белков штамма-продуцента составила менее 100нг на 1 мл. Таким образом, по перечисленным критериям наш ДНК-иммуноген по перечисленным параметрам качества соответствует ГФ РФ.

Из кроличьих сывороток было получено 30 мл суммарных иммуноглобулинов с концентрацией 10 мкгр/мл. Антиген СVVV3, наработанный в линии эукариотических клеток НЕК293, специфически связывается с иммуноглобулинами IgG из кроличьих сывороток после иммунизации ДНК-иммуногеном рСМV-3Таg-3А-СVVV3 (рисунок 3).

Рисунок 1. Структура плазмиды рСМV-3Таg-3а-СVVV3 с праймерами, необходимыми для секвенирования вектора вместе со вставкой

Рисунок 2. Анализ образца рСМV-3Таg-3А-СVVV3 с помощью ВЭЖХ. Суперспирализованная изоформа – пик на 6,26 мин

Figure 1. Structure of plasmid pCMV 3Tag 3a-CVVVV3 with primers required for sequencing the vector together with the insert

Figure 2. Analysis of the pCMV 3Tag 3A-CVVVV3 sample by HPLC. Superspiralized isoform - peak at 6.26 min

Рисунок 3. Проверка экспрессии гибридного белка методом Вестерн-блоттинга. Образец рекомбинантного белка СVVV3, наработанный в культуре клеток НЕК293, нанесен в двух нагрузках. Source: Составлено авторами

Figure 3. Verification of hybrid protein expression by Western blotting. A sample of recombinant CVVVV3 protein produced in HEK293 cell culture was plated in two loads. Source: Compiled by the authors

Обсуждение

В ходе работы был разработан и очищен ДНК-иммуноген для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, содержащий иммуногенные участки структурных белков M, S, N, E β-коронавируса SARS-СоV-2.

Также была подтверждена экспрессия закодированного в нём рекомбинантного белка СVVV3 в клетках млекопитающих. Метод Ве-стерн-блоттинга позволил оценить формирование гуморального иммунного ответа на антиген СVVV3 и предварительно оценить его использование для разработки метода, аналогичного иммунофлуоресцентному анализу [4].

Кролики были двукратно иммунизированы рСМV-3Таg-3а-СVVV3 с адъювантным комплексом ПЭИ-Sabowax, поскольку существуют трудности в достижении достаточной иммуногенности ДНК-вакцин [5]. Также возможен вариант интраназальной иммунизации с добавлением адъюванта.

Разработанная технология получения ДНК-иммуногена приводит к выходу 0,1 мг/г, выходы зависят большей частью от процесса ферментации и производственных мощностей [9]. Для наработки большего количества ДНК-иммуногена процесс ферментации будет усовершенствован.

Разработана схожая ДНК-вакцина ZуСоV-D, кодирующая фрагменты S-белка SARS-СоV-2. Кандидатная ДНК-вакцина индуцирует в том числе нейтрализующие антитела и обеспечивает ответ Th-1, о чем свидетельствуют повышенные уровни IFN-γ (Momin, 2021). Дизайн нашего ДНК-иммуногена позволяет прогнозировать схожие данные исследований иммуногенности и безопасности.

post@vestnik-vsuet.ru Заключение

Разработана плазмида рСМV-3Таg-3а-СVVV3, кодирующая гибридный белок, содержащий иммуногенные участки структурных белков M, S, N, E β-коронавируса SARS-СоV-2, для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Данный ДНК-иммуноген рассматривается как перспективная кандидатная вакцина против SARS-СоV-2. Методом Вестерн-блоттинга подтверждена экспрессия гибридного белка СVVV3 в клетках млекопитающих. Усиление иммуногенных свойств ДНК-иммуногена рСМV-3Таg-3а-СVVV3 возможно изменением способа введения на интраназальный или внутрикожный. Созданный ДНК-иммуноген отвечает критериям кандидатной вакцины против COVID-19 нового поколений и в дальнейшей работе будет изучена иммуногенность и протективность.