Разработка индивидуальных ex vivo моделей и исследование химиочувствительности бластных клеток при острых миелоидных лейкозах

Бесплатный доступ

Короткий адрес: https://sciup.org/170171740

IDR: 170171740

Текст статьи Разработка индивидуальных ex vivo моделей и исследование химиочувствительности бластных клеток при острых миелоидных лейкозах

Материалы и методы . Бласты, полученные из периферической крови или костного мозга пациентов с различными формами ОМЛ культивировали в полной питательной среде (ППС), состоящей из 80 % RPMI-1640, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 10 % оригинальной сыворотки больного, 10 мкл ФГА и 100 ЕД/мл пенициллина. Для определения химиочувствительности клеточной линии к противоопухолевым препаратам были адаптированы к локальным условиям и отработаны 2 метода: микроядерный тест (Метод-1) и флуоресцентная сортировка клеток с определением жизнеспособности по маркировке свободной ДНК (Метод-2). В Методе-1, после предварительного культивирования (24 час.), в пробы добавляли разведенные в ППС препараты или чистую ППС (контроль). Была оценена генотоксичность нескольких противоопухолевых препаратов: цитарабин, даунорубицин, идарубицин, миток-сантрон, интерферон альфа-2a, децитабин (каждый до 3 разведений в ППС, в диапазоне фармакологических сведений о средней равновесной концентрации in vivo). Через 48 час добавляли цитохалазин для блока цитокинеза. Через 24 час готовили микропрепараты и определяли соотношение количества клеток с микроядрами к клеткам без митотического патоморфоза а также общее количество микроядер на 100 клеток. В Методе-2 для сортировки окрашенных антителами CD34 PE, 7 AAD Viability Dye

(Beckman Coulter, USA) образцов использовали клеточный сортер MoFlow Astrios EQ (Beckman Coulter, USA) с тремя лазерами (200мВт 488нм, 55мВТ 405нм, 100мВт 645нм), стандартным набором фильтров, насадкой сопла Jet-in-air 70 мкм, давлением 59,7–60 psi для потока обжимающей жидкости IsoFlow (Beckman Coulter) и 60,9–61,1 psi для потока образца, скоростью анализа до 10000 событий в секунду. Из 300 мкл периферической крови в 2 пробирки отсортировали по 520650 CD34+ жизнеспособных клеток. Клетки культивировали 4 суток (5 мл полной питательной среды, 37 °C, 5 % CO2). В одну из проб после первых суток добавили децитабин в концентрации 1160 нг на 1 мл среды. На 5 сутки маркировкой свободной ДНК определили количество клеток, сохранивших жизнеспособность.

Результаты. Из бластов периферической крови или костного мозга пациентов с ОМЛ удалось получить морфологически однородные стабильные клеточные линии,пригодные для определения чувствительности к противоопухолевой терапии. В Методе-1 кратность различий генотоксичности между всеми пробами и контролем составляла от 1,7 до 14,4 в зависимости от добавленного в пробу препарата. Таким образом, была показана информативность микроядерного теста для определения химиочувствительности бластов in vitro. В Методе-2 удалось показать сохранение достаточной для ограниченного культивирования жизнеспособности отсортированных CD34+ клеток. Однако в связи с отсутствием необходимых для стабильного роста многоцитокиновых сред, погибших клеток в обеих пробах оказалось значительно больше,чем ожидалось. Тем не менее, в пробе с добавлением децитабина живых бластных клеток осталось почти в 2 раза меньше, чем в контроле (9330 и 17633 клеток соответственно), что подтвердило потенциальную информативность и этой методики.

Выводы. Применение результатов определения химиочувствительности выделенных от конкретного больного бластных клеток в мо-

ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 3, 2019

дели ex vivo является одним из перспективных направлений разработки персонифицированных схем терапии. И даже несмотря на то, что пока непосредственный перенос результатов изучения опухолевых клеток вне организма в клиническую практику имеет определенные сложности, полученные при помощи таких методов сведения уже сейчас могут, как минимум, помочь избежать назначения заведомо неэффек- тивных для конкретного пациента препаратов. Это может способствовать снижению общей токсичности терапии и предупреждению развития множественной лекарственной резистентности. В дальнейшем мы планируем усовершенствовать и дополнить предлагаемые методики культивирования и оценки химиочувствительности опухолевых клеток, расширить спектр испытываемых фармакологических агентов.

Статья