Разработка композиционного состава и этапов получения биопрепаратов для защиты растений на основе метаболитов микроорганизмов Bacillus subtilis

Введение. Применение непатогенных почвенных бактерий, живущих в ассоциации с корнями высших растений, усиливает адаптивный потенциал хозяев, стимулирует их рост, а также служит перспективной альтернативой химическим пестицидам. Бактерия Bacillus subtilis признана мощным инструментом биоконтроля, поскольку обладает супрессивными качествами по отношению к широкому набору фитопатогенов благодаря способности продуцировать множество вторичных метаболитов различной химической природы:   циклических липопептидов, полипептидов, белков и непептидных соединений. Информация о структуре активных метаболитов бактерий — антагонистов фитопатогенов, а также механизмах их биологической активности способствует целенаправленному отбору штаммов для создания микробиологических препаратов [3].

B. subtilis может поддерживать постоянный контакт с высшими растениями и стимулировать их рост. Благодаря широкому кругу хозяев, способности формировать эндоспоры и продуцировать различные антибиотики лучше других представителей рода Bacillus вид B. subtilis пригоден в качестве агента биоконтроля. Бактерия обладает супрессивными качествами in vitro по отношению более чем к 20 типам фитопатогенных организмов за счет способности продуцировать значительное количество вторичных метаболитов [1,2].

Биологический контроль с использованием микроорганизмов - перспективная альтернатива широкому применению дорогостоящих пестицидов, которые накапливаются в растениях и неблагоприятно влияют на здоровье человека. Химические пестициды также могут быть летальными для полезных обитателей почвы и вызывать появление штаммов патогенов, резистентных к фунгицидам.

Материалы и методы исследования. В качестве продуцента биологически активных веществ для получения биопрепарата была использована сенная палочка Bacillus Subtilis, полученная в лабораторных условиях.

Для получения культуры сенной палочки необходимо взять немного сена, положить его в колбу с водой, отверстие колбы закрыть ватным тампоном и прокипятить в течение 30 минут. Полученный раствор отфильтровать и поставить в теплое место (оптимальной является температура в 25-26°С). Через 3-4 дня на поверхности жидкости появится бактериальная пленка. Это культура сенной палочки. Затем мы готовим питательную среду и выделяем чистую культуру [4].

После стадии культивирования микроорганизма-продуцента следующим технологическим этапом является выделение и очистка конечного продукта из культуральной жидкости. Для многих микробиологических производств эта стадия начинается с разделения двух фаз, так как конечный продукт может содержаться либо в нативном растворе, либо в микробной массе.

Процесс выделения и очистки разделен на ряд последовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением чистоты конечного продукта [12, 19] (рис. 1).

Рисунок 1 - Схема получения продуктов микробиологического синтеза и последовательность стадий обработки культуральной жидкости

Далее производится концентрирование полученных растворов, экстрагирование целевого продукта, кристаллизация и т.п. Выбор конкретного метода в каждом случае будет зависеть от природы выделяемого продукта, его стабильности к различным внешним воздействиям, а также от требуемой избирательности процесса в связи с наличием других продуктов в нативном растворе [14].

Результаты и обсуждение.

Исследование влияния метаболитов микроорганизмов Bacillus Subtilis на ростовые показатели проростков гороха. В ходе эксперимента выявлено, что метаболиты микроорганизмов Trichodepma Viride во всех вариантах проявляют биологическую активность и улучшают ростовые показатели семян гороха в сравнении с контролем. Установлено, что метаболиты микроорганизмов Trichodepma Viride в концентрации 10 ^-2 % проявляют наиболее высокую биологическую активность.

Так длина проростков под влиянием данных метаболитов составляет 0,5 – 2,2 – 3,5 – 4,0 см, масса проростков – 0,6503 – 0,9532 – 2,0045 – 2,4205 г, длина корешков – 0,3 – 1,5 – 2,0 – 3,4 см, масса корешков – 0,0317 – 0,3651 – 0,5811 – 2,6024 г, количество боковых корешков – 2 – 4 – 119-26 шт. Другие концентрации метаболитов показывают результат несколько ниже.

Метаболиты микроорганизмов Bacillus Subtilis в концентрации 10 -4 % – длина проростков составляет – 0,6 – 1,2 – 3,0 – 4,1 см, масса проростков – 0,1471 – 0,66890,8724 – 1,0256 г, длина корешков – 0,1 – 1,9 – 2,4 – 2,9 см, масса корешков – 0,03420,4521 – 1,4023 – 1,5285 г, количество боковых корешков – 1 – 5 – 17 – 21 шт.

Метаболиты микроорганизмов Bacillus Subtilis в концентрации 10 -7 %: длина проростков составляет – 0,1 – 0,6 – 2,6 – 3,3 см, масса проростков – 0,0869 – 0,12451 – 0,7988 – 1,0483 г, длина корешков – 0,2 – 0,6 – 1,5 – 2,4 см, масса корешков – 0,3826 – 0,4321 – 0,4732 – 0,9361 г, количество боковых корешков – 0 – 4 – 10 – 18 шт.

В контрольном варианте без обработки соответствующие показатели ниже в среднем на 30-40% и составляют: длина проростков – 0,1 – 0,6 – 2,7 – 3,1 см, масса проростков – 0,2156 – 0,3584-0,6791 – 0,8424 г, длина корешков – 0,1 – 0,9-1,4 – 2,1 см, масса корешков - 0,0455 - 0,1423-0,3956 - 0,7638 г, количество боковых корешков -0 – 2 – 8-11 шт (Прил. 1-3).

Таким образом, высокие результаты показали варианты с применением метаболитов микроорганизмов Bacillus Subtilis в концентрации 10 -2. %.

Выводы.

• 1.    Получена культуральная жидкость бактерий Bacillus Subtilis для получения метаболитов. Установлено, что к 6 часам культивирования культура клеток вступает в фазу логарифмического роста, где и происходит интенсивное накопление бактериальных клеток, затем к 12 часам от начала культивирования Bacillus subtilis переходит в стационарную фазу, когда идет замедленный рост микроорганизмов.

• 2.    Получены метаболиты из культуральной жтдкости бактерий Bacillus Subtilis. Определена схема получения продуктов микробиологического синтеза и последовательность стадий обработки культуральной жидкости.

• 3.    Ростостимулирующее действие показали варианты с применением метаболитов микроорганизмов Bacillus Subtilis в концентрации 10 ^-2. %.