Разработка метода иммуно- ферментного анализа для обнаружения антигена M.agalactiae овец и коз в биосубстратах

Развитие овцеводства является одной из важнейших задач сельского хозяйства, направленных на увеличение производства продуктов животноводства. Успешному решению этой проблемы в Российской Федерации и Азербайджанской Республике препятствуют инфекционные болезни и в частности, инфекционная агалактия и .листериоз овец. Из известных в настоящее время 102 видов бактерий рода Mycoplasma ля овец и коз наиболее патогенным является Mycoplasma agalactiae (Х.З. Гаффаров и др., 1994; Ф.М. Кулибеков, 2012; Ф.М. Кулибеков, Г.Г. Дильбази, 2015;Talavera S., Goncer А., 1985; Kennedy S„ Bail U.S., 1987; Gaillard-Periin G., 1985; Sarris K. et al., 1987; Montagna C.O., 1988; Sanchis R. et ah, 2000). Как сообщают1 ряд исследователей (Кулибеков Ф.М., Дильбази Г.Г.), под руководством профессора Фарзалиева М.М. в условиях неблагополучных по агалактии овец и коз хозяйствах Азербайджанской Республики были выделены микоплазмы. Изучение роли микоплазм в этиологии инфекционной агалактии овец, выделение и изучение иммунобиологических свойств эпизоотических штаммов М. agalactiae и на их основе создание средств специфической профилактики и лабораторной диагностики указанной болезни, является весьма актуальной проблемой.

Несмотря на значительный период изучения этой болезни, результаты исследований по разработке средств специфической профилактики и лабораторной диагностики, свидетельствуют о том, что эта проблема требует дальнейшей разработки.

Целью настоящей работы явилась разработка метода иммуно- ферментного анализа для выявления антигена возбудителя М. agalactiae в биосубстратах и получение мембранного антигена пригодного при гипериммунизации овец для получения специфических диагностических сывороток. Учитывая при этом что, основной задачей при получении иммуноферментных конъюгатов является сохранение высокой каталитической и иммунологической активности образовавшейся гибридной молекулы белка и фермента. Качество их определяется активностью фермента, высокой специфической активностью иммуноглобулина, используемого для конъюгации, оптимальным соотношением фермента и иммуноглобулина в конъюгате.

Материалы и мегоды исследований.

В исследованиях использовали иммуноглобулины из гипериммунных сывороток крови овец. При этом для гипериммунизации овец получали мембранный антиген из биомассы аттенуированного штамма M.agalactiae А-319 в описании Х.З. Гаффа-рова и соавт. (1994) путем разрушения клеток микоплазм на ультразвуковом дезинтеграторе типа УЗДН-20. Предварительно осажденные клетки ресуспендиро-вали в физрастворе, разбавленном в 20 раз, вносили РНК-азу и ДНК-азу до 1 мкг/см3 для удаления рибосом и ДНК с поверхности цитоплазматических мембран. Разрушение микоплазм проводили при 20 КГц в течение 4 мин в 2 этапа ио 2 мин с минутным интервалом при 2°С. С целью удаления адсорбированных несиецифических белков цитоплазматические мембраны очищали иммуносорбентом, приготовленным на основе антисыворотки к питательной среде, на которой была выращена M.agalactiae. Для сравнительной оценки эффективности используемого мембранного антигена одновременно испытали антигенные препараты, полученные путем дезинтегрирования суспензии микоплазм смесью неполного детергента Твина-40 и этилового эфира. Контрольный (отрицательный) антиген готовили из неинфици-рованной обогащенной питательной среды для микоплазм путем концентрирования ее с помощью ПЭГ-6000 и последующего диализа против 0,2 М фосфатного буфера. Стандартизированные по белку на спектрофотометре СФ-46 мембранные и контрольные препараты использовали в качестве иммунизирующего антигена. Специфические к M.agalactiae сыворотки получали путем иммунизации кроликов и овец мембранными антигенами с содержанием белка 3,3-12,5 мг/см3 по схемам, предложенным Х.З. Гаффаровым и др. (1994). В качестве контроля использовали сыворотки крови клинически здоровых интактных животных. Уровень антител в сыворотках крови животных определяли, в ИФА и РСК. Необходимые для постановки непрямого варианта ИФА меченные ферментом пероксидазой хрена антивидовые глобулины кролика и барана приобретали из

ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф. Гамалеи. Иммуноглобулин G для сенсибилизации планшет получали двухкратным осаждением 50%-ным раствором сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой из гипериммунных сывороток овец.

Результаты исследований. Как известно принцип непрямого сэндвич-метода ИФА для определения антигена включает следующие этапы: сенсибилизация планшета специфическими антителами; внесение искомого антигена; внесение специфических антител; внесение антивидового конъюгата (энзиммеченый антиглобулин); проявление реакции ферментным субстратом. Определяли оптимальную концентрацию сорбирующих диагностических антител. Они составляли 8-10 мт/см3. Субстратной смесью служил 0,04%-ный раствор ортафенилендиамина в 0,1 М цитратно-соленом буфере, содержанием 0,04% перекиси водорода. В качестве твердой фазы были использованы отечественные полистироловые планшеты для иммунологических реакций. Учет результатов ИФА производили визуально и фотометрически мри длине волны 492 нм. Испытание пригодности компонентов набора препаратов для выявления антигена возбудителя инфекционной агалактии осуществляли путем исследований суспензий клеток M.agalactiae, смывов их колоний, а также оболочек и органов инфицированных 50 куриных эмбрионов. В качестве контроля служили оболочки и органы интактных эмбрионов, обогащенная питательная среда для микоплазм, смыв с поверхности 1,3%-ный агаровой среды и контрольные положительные и отрицательные антигены. За титр антигенов и сывороток принимали то их наивысшее разведение, значение оптической плотности (ОП) которого в 2,1 и более раза превышала ОП ингредиентов в контрольных лунках. При этом учитывали отношение величины оптической плотности (ОП492) положительного контроля (Р) к величине ОП492 отрицательного контроля (N) при различных разведениях сорбируемых специфических антител и конъюгатов со стандартной дозой мембранного антигена M.agalactiac (1:600-1:800), При выбранных оптимальных условиях соотношение P/N было близко к 4, а оптическая плотность для отрицательного контрольного антигена была от 0,16 до 0,25. В желточных оболочках развивающихся эмбрионов кур, зараженных M.agalactiac антиген M.agalactiae обнаруживали в титре 1:32 в 33 случаях, а в титре 1:128 - в 10, а в печени эмбрионов в титре 1:64 - 1:256 в 7 случаях. Взвеси оболочек и органов у интактных эмбрионов не проявляли положительной реакции в ИФА. При исследовании суспензии из органов экспериментально зараженных M.agalactiae овец, антиген возбудителя выявляли в лимфатических узлах в титре 1:32-1:64 и в суставной жидкости - 1:641:128. При исследовании в качестве контроля M.bovis с применением специфических антител к М. agalactiae получены отрицательные результаты. При исследовании в тест-системе ИФА смывов колоний с шаровой поверхности и бульонной культуры возбудителя инфекционной агалактии было обнаружено, что антиген M.agalactiae выявляется в титрах 1:80 в жидкой среде и в разведении 1:160 в смыве колоний с агаровой поверхности.

Заключение. Таким образом, изучена и установлена эффективность метода иммуноферментного анализа для выявления антигена возбудителя M.agalactiae в биосубстратах. Установлено, что мембранный антиген из клеток микоплазмы агалактии пригоден для гипериммунизации овец и обеспечивает получение специфических диагностических сывороток с высоким титром антител.

Резюме