Разработка метода определения слизеобразующей способности семян льна обыкновенного как нового селекционного признака

Введение . Особенностью семян культурного и дикорастущих видов рода Лён ( Linum L.) является образование на их поверхности в процессе налива и созревания гидрофильных слизеобразующих полисахаридов, которые во влажной почве или при замачивании в воде переходят в слизевидное гидроколлоидное состояние, формируя вокруг семян слизевые капсулы [1; 2; 3; 4].

Способность слизеобразующих полисахаридов семян льна к набуханию в воде способствует увеличению объёмов поглощения воды семенами и их набуханию при прорастании, обеспечивает удержание в объёме слизи вокруг семени дополнительных запасов воды при подсыхании семенного ложа. Такое свойство семян льна вполне можно отнести к эволюционной адаптации к естественному произрастанию в аридных центрах происхождения культурного и дикорастущих видов льна [2; 5; 6; 7].

В отдельных работах показано, что образующаяся на поверхности семенной оболочки льна слизь может обладать фунгицидными свойствами, препятствуя развитию патогенной грибной микрофло-4

ры, в частности, грибов из рода Fusarium Link., в слизевой зоне вокруг набухающего семени льна в почве [8].

Поэтому исследование объёмов слизевых капсул, образующихся вокруг набухающих семян льна, представляет научный интерес как потенциальное направление селекции на повышение естественной защиты семян льна от патогенной почвенной микрофлоры за счёт увеличения содержания слизеобразующих полисахаридов. При этом определение объёмов семенной слизи в известных исследованиях ограничивалось замачиванием некоторого количества семян и отделением образовавшейся слизи для дальнейшего использования, иногда определением общего объёма слизи, полученного при набухании семян с фиксированной массой исходной навески [5; 9; 10; 11].

Однако прямые методы определения объёмов семенной слизи у отдельных семян льна, необходимые для оценки селекционного материала по этому признаку на начальных этапах селекции, в доступной литературе не обнаружены.

В связи с этим целью настоящего исследования была разработка метода определения объёмов семенной слизи, образующейся при набухании отдельных семян масличного льна.

Материалы и методы. Исследования проводили в 2020–2022 гг. в ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар. Для изучения полиморфизма линейных размеров и объёмов сухих и набухших семян, размеров и формы слизевых капсул и общей слизеобразующей способности семян использовали сорта масличного льна РФН, Ы 117, ФЛИЗ, ВНИИМК 620 ФН и Снегурок. Для исследований в каждом сорте отбирали по 10 типичных семян в 4-кратной повторности. Семена изучаемых сортов индивидуально измеряли электронным штангенциркулем с точностью до двух знаков после запятой. Математической основой для вычисления объёма и эллипса продольного и поперечного сечений семян изучаемых сортов масличного льна служили известные уравнения объёма трёхосного сплюснуто-вытянутого эллипсоида и эллипса [12; 13; 14].

Дли визуализации объёмов слизевых капсул набухших семян льна использовали методы помещения набухших и ослизнённых семян льна на гидрофобную поверхность; помещения ослизнённых семян в гидрофобную жидкость (вазелиновое масло); помещения сухих семян льна в разработанную авторским коллективом в режиме «ноу-хау» буферную жидкость, окрашенную метиленовым синим красителем. Статистический анализ полученных результатов включал стандартные расчёты выборочных средних х. и коэффициентов вариации C у .

Результаты и обсуждение. В связи с перспективностью селекции льна обыкновенного, включая масличные формы, на увеличение массовой доли семенных слизеобразующих полисахаридов необходима разработка метода определения слизеобразующей способности семян и сопутствующих параметров, таких как линейные размеры и объёмы слизевых капсул. А поскольку слизи образуются из слизеобразующих полисахаридов по всей поверхности семян, то наиболее вероятно, что форма слизевой капсулы будет повторять форму семени. Семя льна обыкновенного у подавляющего большинства коллекционных сортообразцов и сортов имеет округло-сжато-вытянутую эллипсовидную форму с небольшим изгибом в базальной части семени в зоне расположения фуникулуса (рубчика) и апикальной части первичного корешка под семенной оболочкой. Но в целом геометрическая проекция формы семени льна при виде с любой стороны сохраняет визуальное подобие с эллипсом (рис. 1).

Рисунок 1 - Форма семени масличного льна, сорт ВНИМК 620 ФН:

а - вид сверху; б - продольный вид сбоку; в - поперечный вид сбоку

В трёхмерном пространстве объёмным производным от эллипса является эллипсоид. Из всех типов эллипсоидов наиболее близок к форме семени льна трёхосный тип сплюснуто-вытянутого эллипсоида с неодинаковыми длинами полуосей a, b, c (рис. 2).

Рисунок 2 - Трёхосный эллипсоид в декартовой системе координат с векторами симметрии е і , е 2 , е з [12]: а - длина полуоси ширины от центра эллипсоида; b - длина полуоси длины; c - длина полуоси высоты от центра эллипсоида

Уравнение объёма V эллипсоида является производным от классического уравнения объёма шара Архимеда (1).

4    ,

У = - ⁿr 3 ,                 ⁽¹⁾

где r - радиус шара.

Но для описания объёма эллипсоида с неодинаковыми длинами осей произведение трёх радиусов ( r ³) в уравнении объёма шара преобразуется в произведение длин полуосей трёх векторов симметрии а, b, c . Тогда уравнение объёма эллипсоида (2) приобретает следующий вид [13]:

Уравнение объёма трёхосного сплюснуто-вытянутого эллипсоида (2) вполне пригодно для вычисления объёмов отдельных семян масличного льна. Результаты определения объёмов сухих и набухших семян пяти сортов масличного льна представлены в таблице 1.

Таблица 1

Линейные размеры сухих и набухших семян масличного льна

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар, 2022 г.

Количественные параметры семени	Сорт, при n = 40					Среднее по сортам, х̅ .	Коэф-фици-ент вариации C V , %
	РФН	Ы 117	ФЛИЗ	ВНИИМК 620 ФН	Снегурок
Сухие семена
Длина, мм	4,57	3,93	5,06	4,88	4,72	4,63	9,3
Ширина, мм	2,41	2,00	2,48	2,52	2,31	2,34	8,9
Высота, мм	1,05	0,89	1,11	1,07	0,88	1,00	10,7
Объём, мм3	6,09	3,73	7,41	7,07	4,96	5,85	26,0
Набухшие семена
Длина, мм	5,14	4,45	5,72	5,54	5,30	5,23	9,4
Ширина, мм	2,88	2,41	2,99	3,06	2,75	2,82	9,1
Высота, мм	1,29	1,13	1,40	1,35	1,08	1,25	11,1
Объём, мм3	10,23	6,32	12,37	11,39	8,54	9,77	24,5
Отклонения линейных размеров и объёмов набухших семян от сухих, %
Длина, мм	112,5	113,2	113,0	113,5	112,3	112,9	0,5
Ширина, мм	119,5	120,5	120,6	121,4	119,0	120,2	0,8
Высота, мм	122,9	127,0	126,1	126,2	122,7	125,0	1,6
Объём, мм3	168,0	169,4	166,9	161,1	172,2	167,53	2,4

Анализ представленных в таблице 1 данных показывает, что у разных сортов масличного льна линейные размеры сухих семян заметно отличаются. Ещё более заметны различия между отдельными генотипами масличного льна по объёмам семян. К тому же эти данные обладают определённой научной новизной, поскольку показатели объёма семян у сортов масличного льна в более ранних публикациях не обнаружены.

Выявленные межсортовые различия по линейным размерам и объёмам сохраняются и у набухших семян. При этом отклонения линейных размеров набухших семян от аналогичных параметров сухих семян у всех изучаемых сортов сохраняются примерно на одном уровне с низкими коэффициентами вариации выборочных средних по длине – 113 ± 0,5 %; по ширине – 120 ± 0,8 %; по высоте – 125 ± 1,6 %. Такая стабильность различий линейных размеров между сухими и набухшими семенами масличного льна у пяти изучаемых сортов позволяет использовать полученные зависимости в качестве достаточно стабильных коэффициентов увеличения линейных размеров набухших семян без их прямых измерений при массовых анализах.

Поскольку объёмная форма семени льна близка к эллипсоиду, то для вычисления и визуализации продольного и поперечного сечений семян масличного льна вполне пригодно параметрическое уравнение эллипса (3) в канонической системе координат [14]:

rx = a cos t        „ ly = b sin t при 0 — t > 2n,     (3)

где х – координата точки по оси абсцисс;

у – координата точки по оси ординат;

а – длина большой полуоси (длины или ширины семени);

b – длина малой полуоси (высоты семени);

t – параметр угла от 0 до 2 π между направлением оси абсцисс и радиус-вектором не менее чем в 20 + 1 точках по периметру эллипса (добавление координат 21-й точки, аналогичной координатам 1-й точки, позволяет замкнуть кривую эллипса на графике).

В зависимости от того эллипс продольного или поперечного сечения семени рассчитывали, за длину большой полуоси принимали, соответственно, половину длины или ширины семени. Для ускорения вычисления координатных точек эл- липса по размерам длины и ширины семян льна использовали матрицу Excel2 [14].

Результаты вычисления эллипсов продольного и поперечного сечений сухого и набухшего семени масличного льна, на примере семени сорта ВНИИМК 620 ФН, представлены на рисунке 3.

числе и с использованием уравнений (2) и (3), по аналогии с семенами, пока оказались невозможны из-за сложности фиксации границ раздела фаз между гидроколлоидными слизями и водным раствором. Усложняет задачу фиксации набухшей семенной слизи её неоднородный состав, включающий, как минимум, три фракции, отличающиеся разной скоростью гидратации, плотностью и вязкостью [6]. Самая низкомолекулярная фракция семенной слизи в течение нескольких минут после начала увлажнения переходит в раствор. Более вязкие средне- и высокомолекулярные слизевые фракции гидратируются позже и составляют основу слизевой капсулы.

Форма слизевой капсулы из этих фракций слизи на поверхности увлажнённых семян льна сохраняет свою эллипсоидную форму только в объёме раствора. Вне раствора, в силу пониженной вязкости и гравитации, периферийная часть слизевой капсулы стекает вниз и частично расплывается по нижерасположенной поверхности. Причём явление гравитационного стекания части слизи отмечается не только у семян масличного льна, оно свойственно и другим, неродственным видам растений (рис. 4).

г

Рисунок 3 – Усреднённая (при n = 40) форма продольного и поперечного сечений сухого ( а, б ) и набухшего ( в, г ) семени масличного льна на примере сорта ВНИИМК 620 ФН

Рисунок 4 – Характер ослизнения семян некоторых видов цветковых растений после 3-минутной экспозиции в воде (цит. по: [8]):

1 – лён обыкновенный ( Linum usitatissimum L., сем. Linaceae DC ex Perleb);

2 – шалфей мускатный ( Salvia sclarea L., сем. Lamiaceae Mart.);

3 – рыжик посевной ( Camelina sativa (L.) Crantz., сем. Brassicaceae Burn.)

Однако прямые измерения линейных размеров слизевых капсул, в том

Показанная на рисунке 4.1 слизь на поверхности семени льна представляет собой преимущественно низкомолекулярную фракцию с повышенной текучестью. При этом у шалфея мускатного (рис. 4.2) и рыжика посевного (рис. 4.3) наличие заметного слоя слизи в верхней части семян указывает на гидратацию более вязких фракций.

Модифицирует формирование слизевых капсул разная скорость гидратации фракций, составляющих семенную слизь. У семян масличного льна этот процесс завершается только через 8–9 ч после замачивания семян [6]. К этому времени большая часть низкомолекулярных фракций переходит в окружающую водную среду, в том числе в почвенный раствор, и может горизонтально или вертикально мигрировать на различные расстояния от семени под воздействием гравитации или возможных разнонаправленных микропотоков в водной среде. Поэтому в наших экспериментах легкорастворимая, низкомолекулярная фракция слизи семян льна, как самая подвижная, не учитывалась.

Техническая задача достаточно надёжной фиксации границ слизевых капсул вокруг увлажнённых семян масличного льна практически не была решена до настоящего времени. Поэтому с целью определения способа визуализации слизевых капсул вокруг семян льна нами была проведена серия модельных экспериментов (рис. 5).

Наиболее наглядные результаты были получены путём помещения набухших и ослизнённых семян льна на гидрофобную поверхность (рис. 5 а ); путём помещения ослизнённых семян льна в гидрофобную жидкость (вазелиновое масло) (рис. 5 б ); путём ослизнения семян льна в буферной жидкости, окрашенной метиленовым синим красителем (рис. 5 в ).

Фиксация слизевых капсул вокруг увлажнённых семян льна на гидрофобной поверхности после их удаления из воды (см. рис. 5 а ) позволяет провести измерение их длины и ширины. Однако гравитационное стекание слабовязких слизей с верхней поверхности семян не позволяет объективно измерить толщину слизевых капсул.

б

в

Рисунок 5 – Визуализация границ слизевых капсул вокруг увлажнённых семян масличного льна:

а – на гидрофобной поверхности;

б – в объёме вазелинового масла;

в – в окрашенном буферном растворе

Нанизывание на иглы семян льна, их полное ослизнение в воде и последующий перенос в вазелиновое масло позволяют визуализировать не только длину и ширину, но уже и толщину слизевых капсул (см. рис. 5 б ). Однако сквозные повреждения иглой боковых поверхностей семян льна с образованием выступов частей повреждённых оболочек в зонах укола вносят искажающие изменения в естественную конфигурацию и толщину слизевых капсул. Кроме этого, прокалывание иглой мелких семян нередко приводит к их раскалыванию. Также не всегда удаётся сделать проколы точно в центре семени, что влечёт за собой искажение формы слизевой капсулы непосредственно возле места прокола.

Ещё один способ визуализации слизевых капсул основан на помещении семян льна в разработанный нами буферный раствор, окрашенный метиленовым синим красителем. При этом краситель ме- тиленовый синий частично вступает в реакцию с периферийными компонентами слизи, формируя на ее внешней границе тёмноокрашенный окаймляющий осадок, что позволяет визуализировать и определить размеры слизевой зоны (см. рис. 5в).

Средне- и высокомолекулярные фракции слизи, формирующие слизевую капсулу, окрашиваются метиленовым синим слабо, что позволяет зафиксировать её высоту и форму (рис. 6).

1                   2

Рисунок 6 - Визуализация размеров и формы слизевой капсулы вокруг семени масличного льна в окрашенном буферном растворе на примере сорта ВНИИМК 620 ФН: 1 - положение ненабухшего семени в буферном растворе; 2 - положение набухшего и слизевой капсулы в буферном растворе; а - ненабухшее семя; б - набухшее семя; в - буферный раствор; г - слизевая капсула; д - дно ёмкости

Плотность сухих семян льна выше плотности воды, поэтому после смачивании всей поверхности они опускаются на дно ёмкости (см. рис. 6 а ). Семенные слизевые капсулы также начинают формироваться в придонном слое раствора. Но после полного ослизнения оболочки семя льна приподнимается над поверхностью дна ёмкости на высоту, близкую к толщине набухшего семени (см. рис. 6 б ). Визуально толщина слоя слизевой капсулы вокруг набухшего семени на рис. 5 б также близка к его толщине.

Линейные размеры слизевой капсулы в окрашенном буферном растворе определяются так же, как и размеры семени льна - измерением длины и ширины области слизи, но в её проекции на поверхность в виде окаймлённой осадком зоны (рис. 7).

Рисунок 7 - Оси линейных измерений проекции слизевой капсулы в буферном растворе: а - длина; b - ширина

Поскольку в подавляющем большинстве случаев наших наблюдений видимая толщина слоя слизи по всем осям симметрии слизевой капсулы была примерно равна толщине набухшего семени (см. рис. 5 б и 6 б ), для расчёта объёма слизевой капсулы с включенным семенем вполне подходит уравнение эллипсоида (2) в адаптированном к этому случаю виде (4):

V 4 Па Ь (3 С набухш. семени ),

где С набухш. семени - длина полуоси высоты набухшего семени, или как произведение длины полуоси высоты сухого семени на коэффициент увеличения линейного размера k = 1,25 (или 125 % к сухому семени) при набухании (см. табл. 1).

Но в отличие от сохраняющего форму набухшего семени общая форма слизевой капсулы в придонной зоне ёмкости с буферным раствором вследствие гравитационного стекания приобретает форму полуэллипсоида с плоской нижней стороной (см. рис. 6г). Поэтому уравнение для расчёта координат при построении его сечения (3) требует небольшой модификации в части построения точек по оси ординат у. Конфигурацию продольного и поперечного сечений такой формы слизевой капсулы с включённым в её объём набух- шим семенем можно описать модифицированным уравнением эллипса (5):

x = a слизев. капсулы cos t (1–21)

y = b слизев. капсулы sin t (1–11)

при 0 <  t >  2л при 0 < t > л ,

где а слизев. капсулы – размер полуоси длины а или ширины б (см. рис. 7) проекции слизевой капсулы;

b _{слизев. капс} у _лы – размер полуоси высоты слизевой капсулы, рассчитанной как переменная 3 c набухш. семени в уравнении (4);

t (1–21) – параметр угла от 0 до 2 π между направлением оси абсцисс по полуоси a и радиус-вектором в 21 точке по периметру эллипса;

t (1–11) – параметр угла от 0 до π в 11 точках верхней половины периметра эллипса.

Полученные результаты расчёта продольного и поперечного сечений формы слизевой капсулы с учётом гравитационного стекания периферийных участков к плоской придонной поверхности и включённого в объём капсулы набухшего семени, сечение которого вычислено по уравнению (2), представлены на рисунке 8.

При этом для математической компенсации гравитационной деформации формы слизевой капсулы в буферном растворе для расчёта эллипса по измерениям длины и ширины достаточно применить классическое параметрическое уравнение эллипса (3). В результате внешний вид продольного и поперечного сечений слизевых капсул, полностью сохраняя расчётные величины объёма, приобретает симметричный эллиптический вид (рис. 9).

Сечение слизевой капсулы с семенем

Сечение набухшего семени

а

Ширина капсулы, мм

Сечение слизевой капсулы с семенем Сечение набухшего семени

б

Рисунок 8 – Форма продольного и поперечного сечений слизевой капсулы семени масличного льна при придонном расположении в буферном растворе на примере сорта ВНИИМК 620 ФН а – продольное сечение; б – поперечное сечение 10

Рисунок 9 – Форма продольного и поперечного сечений слизевой капсулы вокруг семени льна при компенсации деформирующего влияния гравитационного стекания, сорт ВНИИМК 620 ФН: а – продольное сечение; б – поперечное сечение

В целом использование математических алгоритмов на основе уравнений трёхосного эллипсоида и эллипса впервые удалось установить форму и объём семян льна и их семенных слизевых капсул на примере пяти сортов масличного льна селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК.

На основании проведённых исследований и полученных результатов предложен новый признак – слизеобразующая способность семян льна обыкновенного, и выведено его уравнение (6):

М =

V слизев . капсулы — V Ha6yx . ceMeH и V набух . семени

100,

где V слизев.капсулы – объём слизевой капсулы с набухшим семенем;

V набухш. семени – объём набухшего семени;

M – слизеобразующая способность семян льна (от лат. «mucus» – слизь).

Результаты исследований показывают наличие значительного генотипического полиморфизма по таким новым для масличного льна признакам, как объём слизевой капсулы с семенем, чистый объём слизи отдельного семени, общая слизеобразующая способность семени (табл. 2).

Таблица 2

Оценка слизеобразующей способности семян сортов масличного льна селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК с использованием нового метода

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2022 г.

Сорт масличного льна	Объём семени, мм3		Размеры слизевых капсул с семенами, мм, мм3				Чистый объём слизи, мм3/се-мя	Слизе-образую-щая способ-ность семени, М , %
	сухо-го	набух-шего	длина	ширина	толщи-на	объём
РФН	6,09	10,23	9,21	7,35	3,18	106,89	96,56	944
Ы 117	3,73	6,32	8,32	6,62	2,72	74,22	67,88	1075
ФЛИЗ	7,41	12,37	10,22	7,87	3,39	132,36	119,80	968
ВНИИМК 620 ФН	7,07	11,39	9,01	7,00	3,30	95,76	83,74	735
Снегурок	4,96	8,54	9,54	7,38	2,62	89,42	81,08	949

Как следует из данных, представленных в таблице 2, из пяти изучаемых сортов масличного льна максимальный объём слизевых капсул с семенами формировался у коричневосемянного сорта ФЛИЗ – 132,36 мм3/семя; минимальный – у жёлто-семянного сорта Ы 117 – 74,12 мм3/семя.

Максимальный и минимальный чистый объём слизи в расчёте на одно семя также зафиксирован у этих сортов – 119,99 и 67,88 мм3 соответственно. Мак- симальная общая слизеобразующая способность семян (М), как отношение чистого объёма слизи к объёму набухшего семени, отмечена у сорта Ы 117 – М = 1074 %, отличающегося самым низким объёмом слизевых капсул. А лучший по чистому объёму слизи сорт ФЛИЗ по показателю слизеобразующей способности семян хотя и оказался на втором месте (М = 970 %), но заметно отстал от лидера – на 104 %.

Исследования по изучению слизеобразующей способности семян масличного льна продолжаются с целью выявления коррелятивных связей этого показателя с другими хозяйственно ценными признаками.

Заключение. Впервые предложена и реализована концепция визуализации и измерения линейных размеров слизевых капсул вокруг отдельных набухших семян масличного льна.

При разработке этой концепции для математического описания формы семян масличного льна подобраны наиболее близкая по форме и пропорциям трёхмерная геометрическая фигура – эллипсоид, и соответствующие математические алгоритмы вычисления её объёма, поперечного и продольного сечений.

Предложены и испытаны различные способы визуализации границ слизевых капсул вокруг увлажнённых семян масличного льна. Среди них выбран наиболее наглядный способ: замачивание сухих семян льна в буферном растворе с красителем с последующей фиксацией размеров образовавшихся вокруг семян слизевых зон.

Для вычисления сечения придонных полуэллипсоидных форм слизевых капсул семян масличного льна при гравитационном стекании периферийных участков низкомолекулярной фракции слизи к плоской придонной поверхности применён модифицированный алгоритм на основе параметрического уравнения эллипса.

Практическое использование выбранного математического алгоритма впервые позволило определить слизеобразующую способность семян у пяти сортов маслич- ного льна селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Результаты вычислений показали наличие значительного генотипического полиморфизма по новым для масличного льна признакам, таким как объём слизевой капсулы с включённым в неё семенем, чистый объём слизевой капсулы отдельного семени и общая слизеобразующая способность семени.