Разработка методики количественной оценки уровня химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток



В. В. Черанев, М. А. Логинова, Д. Н. Смирнова, С. С. Кутявина, И. В. Парамонов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» Федерального медико-биологического агентства, Киров

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ХИМЕРИЗМА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Введение. Количественная оценка уровня химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является обязательным прогностическим инструментом для своевременной диагностики посттрансплантационных осложнений. Несмотря на наличие большого разнообразия методов мониторинга уровня химеризма,до сих пор не существует стандартного метода для рутинного использования в клинической практике,что связано с различными чувствительностью и воспроизводимостью каждого из них. Кроме того, современные молекулярно-генетические диагностикумы, существующие на отечественном рынке,как правило зарубежного производства и вследствие этого приводят к высокой стоимости исследований а также не имеют регистрации в Минздраве РФ.

В связи с этим, разработка методики количественной оценки уровня химеризма с высокой чувствительностью после аллогенной ТГСК представляется актуальной задачей.

Цель исследования. Разработать методику количественной оценки уровня линейного и общего химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток методом InDel ПЦР в реальном времени.

Материалы и методы . Материалом для исследования служили биологические образцы пациентов и доноров — периферическая кровь и костный мозг. Сортировку клеточных линий (CD34+; CD3+) проводили с использованием магнитных частиц, конъюгированных с антителами к соответствующим маркерам (Dynabeads, Thermo Fisher Scientific). Препараты ДНК для оценки уровня химеризма были получены методом колоночной фильтрации с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAgen, Германия). Для проведения количественной ПЦР в режиме реального времени в качестве флуоресцентной метки зонда использовали 5´-FAM, в качестве гасителя флуоресценции зонда — 3´-RTQ. Детекцию сигнала проводили на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия).

Результаты. Мониторинг количественного химеризма включает в себя три последовательных этапа:1) поиск информативных маркеров (InDel) для пациента и донора (позволяет выявлять маркеры, обнаруживаемые у пациента, но не детектируемые у донора, и наоборот); 2) оценка эффективности ПЦР в реальном времени (проводится в случае выявления лишь одного информативного маркера); 3) собственно анализ уровня химеризма после ТГСК. В ходе анализа данных литературы была сформирована панель олигонуклеотидов, содержащая праймеры и зонды к двадцати шести маркерам и к одному референсному гену. Для каждого маркера была проведена оценка работоспособности праймеров и зондов, в ходе которой из первоначально сформированной панели был исключен один маркер (S06). Далее была оценена эффективность ПЦР в реальном времени для одного из маркеров (S01a) при различных количествах ДНК, вносимых в реакцию (250 нг 200 нг, 150 нг, 100 нг, 50 нг, 25 нг). В ходе этого эксперимента было получено оптимальное количество ДНК на реакцию (70 нг), обеспечивающее разрешающую способность методики не менее 0,1 % с возможностью оценки линейного химеризма. В связи с тем, что для подсчета результатов используется экспоненциальная зависимость между количеством специфичной ДНК в пробе и пороговым циклом информативного маркера (Ct), а при измерении высоких значений уровня химеризма усиливается влияние случайных факторов и погрешности в оценке порогового цикла (Ct), это приводит к получению недостоверных результатов (завышению или занижению). По этой причине ограничением данного метода является невозможность точной оценки высокого уровня химеризма (60 % и более), что требует применения других методик (STR-ПЦР, FISH и т. д.).

Выводы . 1. Разработана методика количественной оценки общего и линейного химеризма методом ПЦР в реальном времени с использованием панели праймеров к генетическим полиморфизмам— InDel. 2. Методика характеризуется высокой чувствительностью (до 0,1 % собственных клеток пациента), что позволит выявлять возможный рецидив заболевания на ранних сроках.