Разработка методики определения хлорамфеникола в мясных продуктах

Хлорамфеникол (левомицетин) является антибиотиком широкого спектра действия. В ветеринарной медицине хлорамфеникол используют для лечения и профилактики возникновения у сельскохозяйственных животных инфекций, вызванных анаэробными бактериями или устойчивых к другим противомикробным средствам. Хлорамфеникол хорошо всасывается при пероральном и парентеральном поступлении, медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов [13]. Для лечения человека хлорамфеникол используют с большой осторожностью. При исследовании токсичных свойств препарата выявлены ге- нотоксичность хлорамфеникола и его метаболитов, эмбриотоксичность, канцерогенный риск для человека и отсутствие корреляции в системе «доза–реакция» в случаях апластической анемии, вызванной лечением хлорамфениколом [8, 10, 11].

При употреблении продуктов животного происхождения, содержащих остатки ветеринарных лекарственных препаратов, в организме человека вырабатывается резистентность к антибиотикам, могут развиваться дисбактериоз, аллергические реакции, снижается иммунитет. При постоянном употреблении пищи с остатками ветеринарных лекарственных препаратов повышается нагрузка на системы и органы, от-

ветственные за выведение чужеродных соединений из организма (печень, почки) [2].

В странах ЕЭС в отношении ряда ветеринарных лекарственных препаратов, в том числе хлорамфеникола, действует запрет на их содержание в пищевых продуктах. Так, в регламенте стран европейского экономического союза (ЕЭС) № 2377/90 от 1990 г. представлены вещества, содержание которых недопустимо в продуктах в сыром и готовом виде, в их числе присутствует хлорамфеникол. В документе Комиссии Codex Alimentarius, утвержденном в июле 2012 г. на 35-й сессии Комиссии, перечислены запрещенные ветеринарные лекарственные препараты, для которых не может быть установлено никакое допустимое остаточное содержание в продуктах, так как остатки в любом количестве создают риск здоровью человека. В данном перечне присутствует хлорамфеникол [7]. В Российском законодательстве действует технический регламент Таможенного союза, в соответствии с которым не допускается присутствие хлорамфеникола в продуктах убоя, предназначенных для производства мясной продукции (примечание: < 0,0003 мг/кг) [6].

Действующие методические указания МУК 4.1.1912-04 устанавливают порядок определения хлорамфеникола в продуктах животного происхождения двумя методами – жидкостной хроматографией, обеспечивающей селективность определения, но имеющей низкую чувствительность – 0,01 мг/кг (арбитражный метод), и иммуноферментным анализом с высокой чувствительностью определения – 0,000012 мг/кг, но недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов [4]. В соответствии с ГОСТ Р ИСО 13493-2005 «Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии» минимально определяемая концентрация хлорамфеникола в мясе составляет 0,0065 мг/кг.

В целях обеспечения контроля безопасности продуктов питания необходимо совершенствовать существующие и разрабатывать новые более высокочувствительные и селективные методики анализа. В настоящее время максимальную чувствительность и наиболее точную идентификацию сложных органических соединений в продуктах питания и других биологических образцах обеспечивают современные инструментальные методы газовой и жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС и ЖХ/МС) [1, 5, 13].

Цель исследования – разработка методики определения хлорамфеникола в мясной продукции с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с масс-селек-тивным детектированием (ЖХ/МС).

Материалы и методы. Исследования проведены в лаборатории методов жидкостной хроматографии ФБУН «ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения» на жидкостном хроматографе Agilent серии 1200 с масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем LC/MS 6460 Agilent Technolo-giesи с ионизацией электростатическим распылением (ESI). В качестве стандартного образца использовали хлорамфеникол чистотой ≥98 % (пр-во SIGMA-ALDRICH).

Разработка методики определения хлорамфеникола в продуктах питания включала следующие этапы:

• –    оптимизация условий масс-спектрометрического анализа;

• –    извлечение хлорамфеникола из образца и очистка извлеченной пробы;

• –    количественное определение и качественное подтверждение наличия остатков хлорамфеникола в пробе.

Оптимизацию параметров масс-спектрометрического детектора для качественного определения хлорамфеникола проводили в автоматическом режиме при использовании программы «Optimizer». По литературным данным в условиях ионизации распылением в электрическом поле (ESI) регистрируются отрицательно заряженные частицы хлорамфеникола, в связи с этим исследования проведены в режиме отрицательной ионизации.

При отработке оптимальных условий хроматографического разделения стандартного образца хлорамфеникола с компонентами матрицы предварительно определили оптимальную длину волны диодно-матричного детектора.

Изучение разделения хлорамфеникола с компонентами матрицы проводили на колонках для обращено-фазной хроматографии: Poroshel 120 EC-C18 длиной 50 мм и внутренним диаметром 3,0 мм, размер частиц 2,7 мкм; Eclipse XDB-C18 длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, размер частиц 5 мкм; Bonus RP длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, размер частиц 1,8 мкм.

Для выявления мешающего влияния матричных компонентов анализировали образцы мясного фарша с добавлением и без добавления хлорамфеникола в оптимальном режиме элюирования на колонке Bonus RP.

Следующий этап разработки методики анализа хлорамфеникола в мясных продуктах включал отработку способа подготовки проб к анализу. Подготовка пробы влияет на все последующие стадии анализа антибиотика и, следовательно, является критически важным для абсолютной идентификации, подтверждения и количественного определения аналита. Масс-спектрометрия позволяет использовать более простые универсальные методы очистки. Вместе с тем эффективная очистка матрицы является необходимой мерой, так как компоненты, присутствующие в матрице, могут повлиять на производительность масс-спектрометра, в частности, посредством снижения сигнала детектора [14].

Для выбора оптимального способа подготовки проб мясных продуктов к анализу методом ЖХ/МС проведены экспериментальные исследования по определению эффективности извлечения хлорамфеникола из матрицы с использованием подходов, рекомендуемых в научной и методической литературе, – жидкостной и твердофазной экстракции.

Исследования по определению степени экстракции хлорамфеникола из образцов мяса осуществляли методом «введено– найдено». В образец мясного фарша навеской 10 г вносили известное количество хлорамфеникола, задавая определенную концентрацию антибиотика в мясе (мг/кг). Степень экстракции считали как отношение извлеченного количества к общему (начальному) количеству хлорамфеникола в образце по формуле

„ A - 100 R =------ ,

N где R – степень экстракции хлорамфеникола, %; А – извлеченное количество вещества, мкг; N – общее (начальное) количество вещества, мкг.

Образцы анализировали в оптимальных условиях работы жидкостного хроматографа и масс-спектрометрического детектора.

Техника выполнения процедуры жидкостной экстракции анализируемого вещества из биологической матрицы включала гомогенизацию образца, извлечение аналита из образца подходящим органическим растворителем, разделение фаз, удаление белков, липидов и других соединений из экстракта. По литературным данным для извлечения хлорамфеникола из продуктов питания методом жидкостной экстракции использовались органические растворители: этилацетат, ацетонитрил, смесь этилацетата с ацетонитрилом, смесь хлороформа и ацетона, смесь ацетонитрила и ацетатного буфера (рН 5,0). Среди перечисленных растворителей наибольшее применение в практике анализа хлорамфеникола нашел этилацетат.

Исследования по определению эффективности извлечения хлорамфеникола из мяса этилацетатом проводили по схеме: в образец мясного фарша массой 10 г вносили хлорамфеникол в количестве 0,192 мкг и экстрагировали дважды 20 см3 этилацетата в течение 10 мин; объединенный экстракт высушивали в токе воздуха при температуре 45 °С до образования маслянистого остатка. Образец очищали от белков и жира, добавляя в пробу метанол (для осаждения белков), соль хлорид натрия и 20 см3 гексана (для удаления жиров). После перемешивания и центрифугирования гексановый слой отбрасывали и повторно очищали. Оставшийся раствор дважды экстрагировали этилацетатом. Высушенный экстракт пере-растворяли в смеси метанол:вода и анализи- ровали аликвоту на приборе. Приведенная процедура подготовки проб обеспечивает получение надежных и высокочувствительных результатов анализа хлорамфеникола. Эффективность экстракции данным способом составила 70–99,9 %.

Согласно действующим методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 извлечение хлорамфеникола проводится этилацетатом в присутствии буферного раствора. Этилацетатный экстракт очищается от примесей петролейным эфиром и анализируется методом ВЭЖХ.

Изучена возможность применения в качестве пробоподготовки для анализа хлорамфеникола метода QuEChERS, технически представляющего метод дисперсионной твердофазной экстракции, успешно применяющегося в аналитической химии для извлечения пестицидов, антибиотиков и других загрязняющих веществ из продуктов питания растительного и животного происхождения. Пробоподготовка основана на экстракции контаминантов ацетонитрилом из гомогенизированной пробы в присутствии солей, в основном MgSO 4 и NaCl, в условиях оптимального значения рН среды, задаваемого с помощью буферных растворов, и очистке экстракта насыпными полимерными сорбентами. В ходе исследований изучены два варианта пробоподготовки по методу QuEChERS.

Для количественного определения хлорамфеникола использовали метод внешнего стандарта – устанавливали зависимость интенсивности сигнала детектора от концентрации анализируемого соединения в мясе и рассчитывали градуировочный коэффициент.

Важной особенностью анализа химических соединений в биологических субстратах, к которым относятся пищевые продукты, является влияние многокомпонентной матрицы на конечный результат. Для получения достоверных результатов анализа необходимо учитывать мешающее влияние компонентов матрицы, степень извлечения анализируемого вещества, а также погрешность всех этапов подготовки образца к анализу [1, 3]. В связи с этим при построении градуировочной зависимости пробы с содержанием стандартного образца хлорамфеникола в диапазоне концентраций 0,00005–0,02 мг/кг подвергались обработке аналогично исследуемым пробам – экстракцией этилацетатом с последующей очисткой гексаном. Подготовленные пробы анализировали в оптимальных условиях ЖХ/МС анализа.

Градуировочный коэффициент рассчитывали по формуле

n

∑ C i/ S i

K= i=1 , n где Ci – массовая концентрация хлорамфеникола в градуировочном растворе, мг/кг; Si – среднее значение трех измерений площади пика хлорамфеникола i-й концентрации, усл. ед; n – количество градуировочных растворов.

Для расчета метрологических показателей методики (точности, правильности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности) применяли методы математической статистики.

Метрологические показатели методики определения хлорамфеникола в мясных продуктах устанавливали в соответствии с рекомендациями по межгосударственной стандартизации РМГ 61-2010 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки» и ГОСТ Р ИСО 5725-1÷6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Для получения экспериментальных данных готовили серию стандартных образцов хлорамфеникола в мясном фарше (мг/кг) с концентрациями вблизи нижнего, среднего и верхнего значений диапазона измеряемых концентраций

Результаты и их обсуждение. При сканировании дочерних отрицательных ионов в режиме грубой настройки зарегистрированы родительский ион с отношением массы к заряду (m/z) 321 и 4 дочерних иона с соотношением m/z 152, 257, 151,2 и 121. Максимальный отклик детектора получен для до-

Рис. 1. Спектр поглощения хлорамфеникола в 50%-ном водном растворе метанола, λ max = 278 нм

Рис. 2. Хроматограммы стандартного раствора хлорамфеникола, полученные на колонке Bonus RP при соотношении воды и ацетонитрила 70:30 (1), 60:40 (2), 55:45 (3), 50:50 (4)

черних ионов с m/z 152 и 257. На основании полученных результатов в качестве основного иона выбран фрагмент с m/z=152, подтверждающего иона – фрагмент с m/z=257. В режиме тонкой настройки детектора уточнено образование дочерних ионов с соотношением m/z 152,1 и 257,1. При этом значение оптимального напряжения фрагментатора составило 126 V, значения энергии ячейки соударения для дочерних ионов (СЕ) 12 и 4 V. Полученные значения согласуются с приведенными в литературе данными [9, 12].

На основании спектральной характеристики поглощения хлорамфеникола в ультрафиолетовой области света в диапазоне длин волн 190-400 нм в качестве оптимальной для селективного детектирования хлорамфеникола выбрана длина волны 278 нм (рис. 1).

Установлены времена удерживания и интенсивность сигнала хлорамфеникола для каждой колонки в различных режимах элюирования, варьирующихся по соотношению растворителей (вода/ацетонитрил) в подвижной фазе при скорости элюирования 0,2 см3/мин и температуре колонки 25 °С. В ходе исследований установлено, что на колонке Poroshel 120 EC-C18 при соотношениях ацетонитрила и воды 80:20, 75:25, 70:30 и 60:40 анализируемое вещество практически не удерживается, время выхода менее 1 минуты. На колонке Eclipse XDB-C18 оптимальный режим элюирования достигается при соотношении ацетонитрила и воды 55:45, время выхода хлорамфеникола 3,08 мин. На колонке Bonus RP оптимальное элюирование стандартного раствора хлорамфеникола с учетом времени выхода, высоты и симметрии пика протекает при соотношении воды и ацетонитрила 60:40 (рис. 2).

В дальнейших исследованиях использовали колонку Bonus RP. Оптимальные условия элюирования на колонке Bonus RP длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с размером частиц 1,8 мкм: элюент – смесь воды и ацетонитрила в соотношении 60:40, скорость элюирования 0,2 см3/мин, температура колонки 25 °С. При данных условиях время выхода хлорамфеникола составляет 6,1±0,3 мин. Установлено, что в выбранном режиме элюирования компоненты матрицы полностью разделяются с хлорамфениколом (рис. 3).

Проведенные нами экспериментальные исследования показали, что степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса этилацетатом с очисткой петролейным эфиром составляет 56,4 %.

В первом варианте пробоподготовки по методу QuEChERS экстракция хлорамфеникола этилацетатом проводилась в нейтральной среде, степень извлечения составила 33,2 %. Во втором варианте экстракция протекала в кислой среде (рН=3), степень извлечения хлорамфеникола этилацетатом составила 41,0 %. Результаты изучения

а

Рис. 3. Хроматограммы мясного образца с добавкой ( а ) и без добавки ( б ) стандартного раствора хлорамфеникола, полученные на колонке Bonus RP в оптимальном режиме элюирования

б

степени экстракции хлорамфеникола различными способами пробоподготовки представлены в табл. 1.

При сравнении различных способов пробоподготовки установлено, что максимальная степень экстракции антибиотика из образцов мясного фарша достигается с использованием в качестве растворителя-экстрагента этилацетата с последующей очисткой экстракта гексаном (см. табл. 1). При этом степень экстракции увеличивается от 70 до 99,9 % в зависимости от уменьшения концентрации хлорамфеникола в образце в диапазоне изучаемых концентраций (от 0,00005 до 0,02 мг/кг).

Результаты исследований по определе- нию метрологических характеристик представлены в табл. 2.

Таблица 1

Эффективность извлечения хлорамфеникола из мясной матрицы различными способами пробоподготовки

№ п/п	Способ пробоподготовки	Степень экстракции, %
		с учетом матричного эффекта	без учета матричного эффекта
1	Жидкостная экстракция этилацетатом и очистка экстракта гексаном	70–99,9	101,3
2	Экстракция по методу QuEChERS в нейтральной среде	33,2	91,0
3	Экстракция по методу QuEChERS в кислой среде (рН = 3)	41,0	77,5
4	Экстракция этилацетатом и очистка экстракта петролейным эфиром	56,4	70,5

Таблица 2

Значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости

Точка диапазона измерений хлорамфеникола, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σ r , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) σ R , %	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности р = 0,95), ±δ, %
0,000086	4,49	9,95	25,55
0,0019	2,84	4,41	10,98
0,018	1,22	1,81	4,64

На основании результатов, представленных в табл. 2, можно заключить, что максимальная погрешность измерения хлорамфеникола в мясных продуктах не превышает 26 % в диапазоне измерений от 0,00005 до 0,02 мг/кг включительно.

В ходе апробации методики определения хлорамфеникола в мясных продуктах ( n =17) антибиотик обнаружен в 17,6 % всех проанализированных проб в диапазоне концентраций от 0,00005 до 0,0019 мг/кг (максимальное содержание 0,0019 мг/кг).

Выводы:

– разработана высокочувствительная и селективная методика хромато-масс-спектрометрического определения хлорамфеникола (левомицетина) в мясных продуктах питания с нижним пределом определения 0,00005 мг/кг, позволяющая контролировать остаточное содержание антибиотика в мясной продукции в соответствии с требованиями технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» [6];

– анализ остаточных количеств хлорамфеникола в образцах мясной продукции (говядина, свинина, птица, n = 17) посредством данной методики показал присутствие хлорамфеникола в 17,6 % проб;

– методика может быть рекомендована к применению в лабораториях, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.