Разработка методов специфической диагностики нодулярного дерматита с применением диагностикума оспы овец

Введение . Распространение различных болезней животных в Казахстане является одной из наиболее актуальных проблем животноводства республики. Болезни представляют угрозу не только для продуктивности животных, но и для жизни животных в целом [1].

Инфекционный узелковый дерматит – это трансмиссивное заболевание крупного рогатого скота и азиатских буйволов, которое характеризуется поражением кожи в виде узелков. Эта болезнь эндемична по всей Африке и Ближнему Востоку, а с 2015 г. она распространилась на Балканы, Кавказ, юг Российской Федерации, где болезнь продолжает распространяться, несмотря на принятые меры по ее профилактике [2, 3].

Новые вспышки нодулярного дерматита в России были зафиксированы 25 мая 2016 г. в Краснодарском крае. С 29 мая по 12 июня в Республике Дагестан было найдено 15 очагов заболевания, где они были обнаружены на фермах, в которых содержалось в общей сложности 360 645 животных [4].

Первые случаи нодулярното дерматита КРС в Казахстане были зафиксированы в 2016 г. на западе страны. 7 тысяч животных заболели, из них 1 150 умерли. Вирусный нодулярный дерматит был выявлен в Костанайской, Акмолинской, Северо-Казахстанской и Павлодарской областях.

В 2017 г., благодаря усилиям ветеринарных служб, новых вспышек в регионах удалось избе- жать. Однако новые очаги болезни появились в других регионах страны.

С 2016 по 2018 г. нодулярным дерматитом было поражено большое поголовье КРС и выявлено много очагов заболевания, которые начали распространяться из мест первичных вспышек на границах республики вглубь страны [5].

Нодулярный дерматит – это экзотическое трансграничное заболевание, согласно классификации Международного эпизоотического бюро, оно относится к первой группе особо опасных заболеваний, наряду с сибирской язвой и бешенством, и характеризуется как экономически и социально значимое заболевание. Передача вирусной инфекции осуществляется кровососущими насекомыми, но она также может распространяться и через потребление зараженных кормов или воды, прямым контактом с животными, спариванием или искусственным осеменением [6].

Антигенные свойства, родство и изменчивость вируса нодулярного дерматита изучены не полностью. Антигенно вирус связан с вирусом оспы овец и, возможно, вирусом оспы козы.

При культивировании вируса нодулярного дерматита используются первичные культуры клеток органов ягнят, детей и телят.

Для диагностики вируса нодулярного дерматита в настоящее время используются вироско-пия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлуоресценции, реакция иммунодиффузии в агаровом геле, полимераз- ная цепная реакция (ПЦР), реакция нейтрализации и непрямые флуоресцентные антитела; выделение вируса путем заражения культуры клеток и его обнаружение с помощью электронной микроскопии; а также постановка биоанализа на естественно восприимчивых животных.

Нодулярный дерматит является относительно новой болезнью, требующей разработки методов диагностики, поэтому изучение возможности диагностировать заболевание с помощью серологических методов диагностики оспы овец является актуальным на сегодняшний день [7, 8].

Из-за сложной эпизоотической ситуации и угрозы дальнейшего распространения нодулярного дерматита на территории Республики Казахстан актуальной задачей является изучение биологических свойств возбудителя с целью разработки высокоэффективных диагностических препаратов и специфических профилактических средств, а также использование серологической диагностики оспы овец с помощью РСК, РДСК, РДП, так как они антигенно связаны с нодулярным дерматитом КРС, что позволило бы в короткие сроки выявить возбудителя и быстро остановить распространение инфекции.

Цель исследования : разработка методов специфической диагностики нодулярного дерматита с применением диагностикума оспы овец.

Задачи исследования : провести исследования, определяющие возможность диагностики нодулярного дерматита КРС при использовании средств и методов диагностики оспы овец.

Объекты и методы исследования . Объекты исследования – кожа КРС с клиническими признаками нодулярного дерматита; кожа здорового КРС; сыворотка крови больного и переболевшего нодулярным дерматитом КРС; сыворотка крови здоровых животных; наборы диагности-кумов для РСК и РДП при оспе овец производства НИИ проблем биологической безопасности (пгт. Гвардейский Жамбылской области Республики Казахстан).

Исследуемый материал от КРС с клиническими признаками нодулярного дерматита (кожа и сыворотка крови переболевших животных) был получен в районной ветеринарной станции г. Аксу Павлодарской области. Для контроля специфичности метода использовали материал, полученный в районной ветеринарной станции г. Аксу Павлодарской области от здоровых животных и животных с проявлением сходных клинических признаков поражения кожи, но без положительной реакции по вирусоскопии. Здесь же для прижизненной диагностики у больных животных были взяты образцы сыворотки крови на разных стадиях инфекционного процесса (начальный период, выраженные признаки заболевания, выздоровление).

Всего исследовано 32 пробы сыворотки крови больных и здоровых животных с антигеном вируса оспы овец и 12 проб органотканевого материала. Все реакции для статистической обработки проводили в пяти вариантах.

В процессе исследования применяли методы вирусоскопии (окраска по методу А.М. Морозова, 1925); РСК в модификации длительного связывания комплемента; РДП по методу Оухтерлони, используя 1 % агар Difco, поддерживая реакцию при температуре (37±1) °C в течение двадцати четырех часов.

Для получения образцов сыворотки крови отбор производился в стерильные пробирки, которые помещали в термостат при температуре (37±1) °С на три-четыре часа. После отделения сыворотки ее разливали в отдельные стерильные пробирки, при необходимости центрифугировали для осаждения клеток крови и использовали в серологических реакциях для обнаружения антител.

Для исследования в серологических реакциях на обнаружение вирусного антигена нодулярного дерматита КРС использовали участки пораженной кожи, из проб которых была приготовлена 20 % суспензия в физиологическом растворе, которую однократно замораживали и оттаивали, центрифугировали при 4000–5000 об/мин в течение 30 мин и супернатант использовали для исследования.

Результат РСК считали положительным, если в двух пробирках с последовательными разведениями испытуемого материала (сыворотки или органотканевого антигена) была полная (задержка гемолиза 100 %) или выраженная задержка гемолиза, по меньшей мере, на 2 креста в каждой пробирке (гемолиз 50 %) или более выраженная (25–0 % гемолиз). За титр испытуемого материала в этом случае принимали последнее его разведение, вызывающее задержку гемолиза на 50 % и более.

Результат РДП в агаровом геле по методу Оухтерлони считался положительным, если между лунками с исследуемым материалом (органотканевой материал или сыворотка крови) и диагностическим препаратом образовались визуально заметные полосы преципитации. Последнее разведение испытуемого материала, вызывающее проявление линии преципитации, принимали за его титр [9].

При исследовании сыворотки крови диагностические антигены вируса оспы овец вводили в центральные лунки в разведении 1 : 2, в периферических исследуемая сыворотка крови была интактной.

При постановке реакции для проверки специфичности и активности диагностических препаратов делали постановку контрольных проб от здоровых животных.

Серологические реакции РДСК, РДП были использованы для определения специфической активности сыворотки крови животных, а также для выявления и количественного определения специфических антигенов вируса нодулярного дерматита КРС в коже больных животных.

В количественной версии РДСК и РДП исследуемый материал использовали в виде суспензии пораженных участков кожи в разведениях от 1 : 2 до 1 : 24, либо сыворотки в разведениях от цельного до 1 : 32, реакции проводили с соответствующими специфическими и контрольными нормальными диагностическими препаратами, взятыми в рабочем разведении, и комплементом с использованием его четырехкратного предельного титра в гемолитической системе.

В качественном варианте РДСК и РДП исследуемый материал использовали в разведении 1 : 2.

Статистическую обработку полученных данных проводили разностным методом Стьюдента, описанным В.А. Чистяковым [10].

Результаты исследования и их обсуждение. Как видно из данных, представленных в таблице 1, вирус-специфические антитела, связанные с антигеном вируса Sheeppox , были обнаружены в сыворотке крови больных животных в разные периоды заболевания. Так, у животных с выраженными клиническими признаками – в титрах до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 2 в РДП. У переболевших животных он составил в РДСК до 1 : 16 и РДП до 1 : 4.

Сыворотка крови от животных с другими заболеваниями и сыворотка крови от здорового скота показали отрицательную реакцию.

Таблица 1

Результаты серологических реакций при исследовании проб сыворотки крови больного КРС с антигеном вируса оспы овец

Испытуемые сыворотки крови от животных	Кол-во проб	Антиген вируса оспы овец
		РДСК	РДП
С выраженными клиническими признаками	12	1 : 2–1 : 8	Ц–1 : 2
Выздоровевших (реконвалесцентов)	4	1 : 4–1 : 16	1 : 2–1 : 4
Больных дерматитом без положительной вирусоскопии	10	–	–
Здоровых	6	–	–

Из данных таблицы 2 видно, что при использовании специфической сыворотки для вируса оспы овец антигены нодулярного дерматита КРС были обнаружены в образцах кожи в титрах от целого до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 4 в РДП.

Исследования по контролю специфичности препаратов кожи КРС, полученных от здоровых и больных животных с другими кожными заболеваниями, показали отрицательный результат.

Таблица 2

Результаты исследования в РДСК и РДП проб органотканевого материала у КРС

Органотканевой материал	Кол-во проб	Сыворотка к оспе овец
		РДСК	РДП
Подтвержденный вирусоскопией на наличие оспоподобного вируса	4	1 : 4–1 : 8	1 : 2–1 : 4
С отрицательной вирусоскопией	4	–	–
Контроль (материал от здоровых животных)	4	–	–

В результате проведенных исследований было установлено, что серологические реакции на нодулярный дерматит у КРС могут быть выполнены с использованием средств и методов диагностики оспы овец.

На основании проведенного исследования ниже предлагается схема прямой и ретроспективной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС (рис.).

Схема прямой и ретроспективной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС

Для прямой диагностики (обнаружения вирусного антигена) в качестве проб патологического материала необходимо использовать кусочки пораженной кожи КРС.

На первом этапе готовят мазок-отпечаток из пораженной кожи на участке, граничащем со здоровой кожей. Мазок окрашивают по методу серебрения по А.М. Морозову.

При отрицательном результате вирусоскопии по А.М. Морозову проводят дальнейшую диагностику на наличие других заразных или незаразных заболеваний, вызывающих дерматиты.

При положительном результате вирусоскопии из участков пораженной кожи готовят суспензию на физиологическом растворе, которую исследуют методами РДСК и РДП с использованием специфических диагностических сывороток при оспе овец. При положительном результате диагноз на нодулярный дерматит КРС считают установленным.

Для ретроспективной диагностики нодулярного дерматита КРС отбирают сыворотки крови от больных и переболевших животных, которые исследуют методами РДСК и РДП с использованием диагностических антигенов, взятых из наборов для диагностики при оспе овец. Положительный результат серологических реакций свидетельствует о болезни или переболевании КРС нодулярным дерматитом.

Этот метод в настоящее время рекомендуется для индикативной и дифференциальной диагностики нодулярного дерматита КРС. С этой целью предлагается к практическому применению для КРС использование разработанной схемы прямой и ретроспективной серологической диагностики заболевания.

Выводы . Нодулярный дерматит является относительно новым и не типичным для Казахстана инфекционным заболеванием КРС.

В реакциях диффузионного осаждения и связывания комплемента с использованием диагностических наборов для оспы овец была подтверждена антигенная связь между нодулярным вирусом КРС и вирусом оспы овец.

Средства и методы лабораторной диагностики оспы овец могут быть использованы для прижизненной и посмертной диагностики нодулярного дерматита КРС с высокой степенью эффективности и надежности.