Разработка микробиологического метода снижения вредоносности фузариоза на сое

Введение. Соя поражается грибными, бактериальными и вирусными болезнями. В нашей стране особой вредоносностью отличаются болезни всходов и увядания растений, одним из возбудителей которых является Fusarium spp. [1; 2; 3]. На посевах сои фузариоз встречается повсеместно. Согласно литературным данным использование живых культур микроорганизмов в борьбе с фузариозными заболеваниями растений является наиболее интересным подходом. Этот метод микробиозащиты не только менее опасен с точки зрения защиты окружающей среды, но и более обоснован с позиции эволюционного осмысления соотношения паразитических и сапрофитных свойств фузариев. Поскольку грибы рода Fusarium являются почвообитающими факультативными паразитами, способными длительное время вести сапрофитное существование, то интродукция антагонистов должна создавать дополнительное давление в сторону элиминирования агрессивных рас [4; 5].

Стратегия биологического метода защиты растений от болезней не ставит задачу полного уничтожения вредных организмов, а ориентируется на регулирование популяции патогена на уровне ниже экономического порога вредоносности [6]. Грамотное и своевременное применение микробиологических средств защиты растений на фоне высокой агротехники может значительно улучшить фитосанитарную обстановку посевов и значительно увеличить урожай, поскольку микробиологические средства защиты растений оказывают положительное влияние на растения и других членов агроценозов.

Целью данной работы являлась разработка эффективного и экологически допустимого микробиологического метода снижения вредоносности фузариоза на сое.

Материалы и методы. Объектом исследований служили: штаммы грибов и бактерий-антагонистов возбудителей болезней масличных культур, тест-культура возбудителя фузариоза сои, лабораторные образцы микробиопрепаратов. Грибы и бактерии, проявляющие антагонизм в отношении патогенных фузариозных грибов, были взяты из коллекции микроорганизмов лаборатории биометода ВНИИМК. В качестве тест-объекта для испытания антагонистической активности штаммов грибов и бактерий был выбран наиболее патогенный и агрессивный для сои изолят гриба Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae (Pk.) Wr. emend Bilai, выделенный из корневой системы сои.

Определение антагонистической активности грибных и бактериальных штаммов проводили методом двойных (встречных) культур [7; 8] на картофель-но-сахарозном агаре (КСА) или среде Кинга В, при двух температурных режимах: 25 и 10 оС. Изучали характер взаимоотношений антагониста и патогена: наличие или отсутствие стерильных зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия патогена. Все активные штаммы грибов при совместном культивировании с возбудителем фузариоза изучали по пяти типам взаимоотношений [9]. Взаимоотношения бактерий с возбудителем фуза-риоза изучали по образованию стерильных зон антибиотического действия или обладающих высоким показателем подвижности [10].

Определение фитотоксичности штаммов проводили методом обработки семян сои опытными партиями микробиопрепаратов и методом погружения подрезанной корневой системы здоровых 7-дневных проростков сои в суспензию штаммов антагонистов. Для изучения ростостимулирующего влияния перспективных штаммов на проростки сои, семена обрабатывали опытными партиями микробиопрепаратов и помещали на проращивание в рулоны из фильтровальной бумаги (в течение 7 дней при температуре 25 оС). Параметрами для последующего анализа служили длина и масса корня и побега.

Защитный эффект жидких культур (ЖК) и водных суспензий (ВС) штаммов антагонистов прорастающего семени и подбор оптимальных норм их применения определяли на фоне искусственного заражения семян сои F. sporotrichiella var. poae в лабораторных условиях во влажной камере методом агаровых блоков [11]. Контроль – чистые семена без нанесения инфекции и с нанесением инфекции. Опыт проводился при 25 ^оС. Активные штаммы антагонистов наращивали на подобранных средах. Перед обработкой семян определяли титр микробиопрепаратов. Титр ЖК и ВС во всех опытах определяли методом Коха [12].

Биологическую эффективность биопрепарата определяли по формуле [13]:

1 О О x (а - b ) C =            , где C – биологическая эффективность;

a – количество больных растений в контроле;

b – количество больных растений в варианте.

Для определения колонизирующей активности и защитного эффекта штаммов антагонистов корней проростков сои использовали методические рекомендации по оценке и отбору растений подсолнечника на устойчивость к фузариозной корневой гнили [14]. Оценку степени поражения проростков возбудителем фу-зариоза производили согласно разработанной нами 6-балльной шкале.

Для создания искусственного фона заражения почвы фузариозом в лабораторных условиях на основе общепринятых методик [15; 16] нами были испытаны различные способы и нормы внесения инфекционного начала фитопатогена [17]. Учеты производили на 7 и 10-й день после посева.

Изучение физиологических особенностей перспективного штамма антагониста 14-3 Pseudomonas sp. проводили на жидкой питательной среде Кинга В. Культивирование микроорганизма осуществляли глубинным способом на качалке со скоростью вращения 195 об./мин, в колбах Эрленмейера (750 мл) при объеме среды 150 мл. Оптимальные параметры физиологических признаков определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл жидкой культуры (титр). Повторность в каждом опыте – 3-кратная. Для определения оптимальной температуры культивирования, штамм бактерии выращивали при температурах 20, 25, 30 и 35 °С. Для определения оптимальной кислотности среды, pH устанавливали в пределах 3, 5, 6, 7, 8, и 10, добавляя лимонную кислоту или щелочь (4Н раствор NaOH). Устанавливали оптимальные источники углеродного и азотного питания. Источниками углеродного питания служили глюкоза, сахароза, глицерин и меласса. Источниками азотного питания служили азотнокислый натрий, пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты. При подборе оптимальных питательных сред для выращивания перспективного штамма бактерии испытывали ряд сложных питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ), Кинга В, Чапека для бактерий, пептонодрожжевая, в состав которых вхо- дят минеральные соли, сахара, микроэлементы, кукурузный и дрожжевой экстракты.

Для изучения динамики периодического роста, глубинное культивирование штамма бактерии осуществляли при оптимальных условиях в течение 4 суток, с предварительным внесением посевной (маточной) культуры (2 % от объема питательной среды). Для выращивания культуры использовали питательную среду Кинга В. Пробы для анализа брали через 8, 16, 24, 36, 48 и 72 часа после начала культивирования.

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар [8].

Определение совместимости штаммов-продуцентов микробиопрепаратов с перспективными пестицидами проводили, используя модифицированный метод диффузии в агар, разработанный для определения антибиотической активности микроорганизмов [18; 19].

Результаты и обсуждения. На первом этапе скрининга тестировали 20 грибных штаммов из коллекции перспективных штаммов антагонистов фитопатогенов масличных культур лаборатории биометода ВНИИМК, представленных родами Trichoderma , Penicillium , Chaetomium , Trichothecium , Sordaria , Talaromyces и классом Basidiomycetes ; и 26 бактериальных штаммов, представленных родами Bacillus и Pseudomonas .

В результате первичного скрининга штаммов грибов и бактерий антагонистов к возбудителю фузариоза сои F. sporo-trichiella var. poae при двух температурных режимах 25 и 10 ºС наибольшую эффективность показали 12 штаммов антагонистов, среди которых 5 штаммов грибов: Tk-1 Trichoderma koningii , T-4 Trichoderma sp ., Sm-1 Sordaria macro-spora, A-1 Basidiomycetes , Хk-1 Chaetomi-um olivaceum , и 7 штаммов бактерий: 12-2 Pseudomonas sp . , 14-3 Pseudomonas sp. , Sgrc-1 P. fluorescens , Far 8 Bacillus sp ., 111 Bacillus sp ., Б-5 B. liche-niformis , Б-12 B. licheniformis [20].

Следующим этапом скрининга стало исследование возможного токсического воздействия активных штаммов антагонистов на культуру сои. Анализ данных показал, что тестируемые штаммы не оказывают негативного влияния на всхожесть семян и не вызывают увядания проростков. Более того, отмечено повышение всхожести семян по сравнению с контролем на 9,0–20,0 % [21].

Изучение ростостимулирующего влияния перспективных штаммов антагонистов на проростки сои показало, что наиболее сильное влияние штаммы оказывали на длину и массу корня. Максимальное увеличение длины корня (на 22,0–25,2 %) наблюдалось у штаммов грибов Xk-1 Ch. olivaceum , Tk-1 T. konin-gii. Максимальное увеличение массы корня (на 13,3–20,0 %) наблюдалось в вариантах с грибом Xk-1 Ch. olivaceum и бактериями 12-2 и 14-3 Pseudomonas sp . Влияние штаммов антагонистов на длину и массу стебля также отмечено, но в меньшей степени (2,6–11,5; 8,5–9,8 % соответственно) [21].

Определение защитного эффекта перспективных штаммов антагонистов прорастающего семени сои от фузариоза, а также отработку оптимальных норм расхода опытных образцов биопрепаратов проводили во влажной камере, используя метод агаровых блоков. Для бактериальных штаммов испытывались нормы от 0,5 до 3,0 л/т, для грибных штаммов от 2,0 до 4,0 л/т. Оптимальными были признаны: для бактериальных штаммов рода Pseudomonas 12-2 и Sgrc-1 – 1,0 л/т, для 14-3 – 2,0 л/т; для грибных штаммов Хk-1 Ch. oli-vaceum и Pv-3 P. verrucosum – 3,0 л/т; для Sm-1 S. macrospora, Tk-1 Tr. koningii и А-1 Basidiomycetes – 4,0 л/т. Максимальная биологическая эффективность на фоне поражения фузариозом в контроле 58,6 % установлена у штаммов: 12-2 Pseudomonas sp . (65,9 %), Хk-1 Ch. olivaceum (59,0 %), 14-3 Pseudomonas sp . (52,2 %), Tk-1 T. koningii (49,8 %), Sm-1 S. macrospora и Sgrc-1 Pseudomonas sp . (47,6 %).

Изучение колонизирующей активности, а одновременно и защитного эффекта, показало, что на жестком (100 %) фоне заражения F. sporotrichiella var. poae максимальную эффективность проявили штаммы: 14-3 Pseudomonas sp., Pv-3 P. verru- cosum, Б-5 B. licheniformis, Sgrc-1 P. fluo-rescens, 12-2 Pseudomonas sp., Sm-1 S. macrospora и Xk-1 Ch. olivaceum. В этих вариантах от 40,0 до 100 % проростков оказались жизнеспособными, тогда как в контрольном варианте жизнеспособных проростков не обнаружено.

Максимальная биологическая эффективность на фоне искусственного заражения семян сои фузариозом в почве отмечена у штаммов Xk-1 Ch. olivaceum (33,9 %), Tk-1 T. koningii (27,2 %) и 14-3 Pseudomonas sp . (20,3 %), при поражении в контроле 79,7 % [17].

Принимая во внимание положение о том, что успешный биоагент должен обладать комплексом положительных свойств на растение [22; 23], мы объединили весь спектр данных, полученных по скринингу активных штаммов антагонистов (рис. 1).

Рисунок 1 – Защитный эффект и колонизирующая активность на фоне искусственного заражения Fusarium sporotrichi-ella var. poae , а также ростостимулирующее действие микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов при обработке семян сои: – защитный эффект во влажной камере;

■ – колонизирующая активность во влажной камере;

– защитный эффект в почве;

■ – ростостимулирующее действие перспективных штаммов антагони- стов на проростки сои.

В результате анализа полученных экспериментальных данных в качестве продуцентов микробиопрепаратов для защиты растений сои от фузариоза были отобраны штаммы Xk-1 Chaetomium olivaceum Cook et Ellis и 14-3 Pseudomonas sp. Данные штаммы не только обеспечивали эффективную защиту семян и проростков сои на жестком фоне искусственного заражения возбудителем фуза-риоза, но и активно колонизировали корень, одновременно оказывая ростостимулирующее действие на культуру сои.

Согласно видовой идентификации штамма 14-3 Pseudomonas sp., проведённой в Центре «Биоинженерия» (г. Москва), изолят 14-3 является штаммом вида Pseudomonas chlororaphis.

Так как гриб Ch. olivaceum является продуцентом микробиопрепарата Хетомин, разработанного ранее в лаборатории биометода , основная часть дальнейших исследований проводилась по изучению бактериального штамма 14-3 P. chlororaphis.

Существенное значение для роста микроорганизмов имеет такой фактор внешней среды, как температура (табл. 1).

Таблица 1

Влияние температуры на рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlorora-phis в процессе периодического культивирования

Штамм	Титр ЖК, КОЕ/мл
	маточная культура	температура, °С
		20	25	30	35
14-3 P. chloro-raphis	6,2х1010	1,4х109	2,9х1012	5,7х1012	2,3х1010

Максимальный титр клеток отмечен при 25 и 30 °С (2,9–5,7 × 10¹²). Следовательно, данный температурный диапазон является оптимальным для роста штамма 14-3 P. chlororaphis.

Одним из важных факторов, определяющих нормальный рост бактерий, является реакция рН среды. При изменении ее в неблагоприятную сторону микроорганизм перестает расти даже в тех случаях, если все остальные условия окружающей среды будут оптимальными [25].

Максимальный титр штамма 14-3 отмечался при рН среды 5,0 (5,3 × 10¹⁴), достаточно высокий при рН 6,0–10,0 (от 3,2 × 10¹² до 2,1 × 10¹³) (табл. 2). Лимитирующим оказалось значение реакции среды 3,0, при котором выживали лишь единичные клетки. Следовательно, для штамма 14-3 P. chlororaphis оптимальным является достаточно широкий диапазон реакции среды – 5,0–10,0.

Таблица 2

Влияние реакции рН среды на рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis в процессе периодического культивирования

Штамм	Титр ЖК, КОЕ/мл
	маточная культура	рН
		3,0	5,0	6,0	7,0	8,0	10,0
14-3 P. chlorora-phis	4,7 × 1014	8,0 × 103	5,3 × 1014	2,1 ×1013	6,0 × 1012	8,4 ×1012	3,2 ×1012

Для определения оптимальных источников углеродного и азотного питания штамм 14-3 P. chlororaphis выращивали при температуре 25,0 °С и рН среды 5,0. Максимальный титр штамма-продуцента отмечен в вариантах с добавлением глюкозы, глицерина и сахарозы (2,8–8,3 ×

1012 КОЕ/мл). Также хорошее развитие культура бактерии получила в варианте с мелассой (2,1 × 1010 КОЕ/мл) (табл. 3).

Таблица 3

Влияние источников углерода на рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis в процессе периодического культивирования

Штамм	Титр ЖК, КОЕ/мл
	маточная культура	источник углерода
		глицерин	глюкоза	сахароза	меласса
14-3 P. chloro-raphis	4,9×1014	4,0×1014	2,8×1014	8,3×1014	2,1×1012

При испытании источников азота установлено, что добавление кукурузного экстракта в среду приводит к полной гибели клеток. На питательной среде с добавлением азотнокислого натрия отмечен низкий титр штамма (3,5 × 103 КОЕ/мл). Тогда как высокий титр штамма 14-3 наблюдался при использовании пептона и дрожжевого экстракта (2,1–4,4 × 1012 КОЕ/мл) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние источников азота на рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis в процессе периодического культивирования

Штамм	Титр ЖК, КОЕ/мл
	маточная культура	источник азота
		пептон	дрожже -вой экс тракт	азотнокислый натрий	кукурузный экстракт
14-3 P. chloro-raphis	2,9×1014	2,1×1014	4,4×1014	3,5×105	0

Определение оптимальных питательных сред для культивирования штамма 14-3 P. chlororaphis проводили на сложных синтетических и органосинтетических средах (табл. 5).

Таблица 5

Влияние питательных сред на рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis в процессе периодического культивирования

Штамм	Титр ЖК, КОЕ/мл
	маточная культура	с		еда
		Кинга В	Чапека для бактерий	пептоно-дрожжевая	мясо-пептонный бульон
14-3 P. chloro-raphis	3,2×1014	3,5×1012	2,2×1010	4,8×1012	2,9×107

Максимальный титр отмечен при культивировании бактериального штамма на пептон-дрожжевой и среде Кинга В (3,5– 4,8 × 1012 КОЕ/мл). Также хорошее развитие культура получила на среде Чапека для бактерий (2,2 × 1010 КОЕ/мл). На МПБ был получен низкий титр (2,9 × 107 КОЕ/мл). При этом, принимая во внимание титр маточной культуры (3,2 × 1014 КОЕ/мл) и посевной объем (3,0 мл на 150 мл стерильной питательной среды), можно сделать вывод о том, что бактерии не размножались, а находились в состоянии покоя, сохраняя жизнеспособность.

Изучение кинетики роста штамма 14-3 P. chlororaphis показало, что лучшими сроками культивирования данной бактерии являются 36–48 часов. Образцы жидкой культуры биопрепарата в этот период характеризовались высоким титром (1,6– 1,7 × 10¹³ КОЕ/мл) (табл. 6).

Таблица 6

Рост штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis в процессе периодического культивирования

Время культивирования, час	Титр жидкой культуры штамма, КОЕ/мл
8	3,0 × 10 6
16	4,2 × 10 9
24	7,8 × 10 12
36	1,6 × 10 13
48	1,7 × 10 13
72	1,8 × 10 12
96	4,3 × 10 10

Антибиотическую активность штамма-продуцента определяли в зависимости от срока периодического культивирования методом диффузии в агар. Установлено, что максимальная антибиотическая активность штамма 14-3 P. chlororaphis к возбудителю фузариоза сои, которая оказывала стойкое сдерживающее действие на патоген, наблюдалась через 72–96 часов культивирования (табл. 7).

Таблица 7

Антибиотическая активность штамма бактерии-антагониста 14-3 P. chlororaphis к возбудителю фузариоза F. sporotrichiella var. poae при периодическом культивировании

Вариант	Срок культи-вирования штамма, час	Срок выращивания Fusarium sporotrichiella var. poae , сут.
		рост мицелия патогена, балл
		2	3	4	5	6	7	10	15
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Контроль 14-3 P. chlor-oraphis	8	2 2	5 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6
Контроль 14-3   P.  chlo- roraphis	16	2 2	5 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6
Контроль 14-3 P. chloro-raphis	24	2 2	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6
Контроль 14-3 P. chloro-raphis	36	2 3	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6	6 6

Продолжение таблицы 7

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Контроль 14-3 P. chloro-	48	2	5	6	6	6	6	6	6
raphis		2	6	6	6	6	6	6	6
Контроль 14-3 P. chloro-	72	3	6	6	6	6	6	6	6
raphis		2	4	5	5	5	5	5	5
Контроль 14-3 P. chloro-	96	3	6	6	6	6	6	6	6
raphis		2	4	4	5	5	5	5	5

Примечание: 2 балла – рост мицелия патогена на 15,0–25,0 % площади питательной среды; 3 балла – рост мицелия патогена на 30,0–40,0 % площади питательной среды; 4 балла – рост мицелия патогена на 45,0–60,0 % площади питательной среды; 5 баллов – рост мицелия патогена на 65,0–80,0 % площади питательной среды; 6 баллов – рост мицелия патогена на 85,0–100,0 % площади питательной среды.

Таким образом, для штамма 14-3 P. chlororaphis установлены оптимальные условия (t – 25–30 ^оС, рН – 5–10) и сроки культивирования (с учетом синтеза максимальной концентрации антибиотических веществ) – 72 часа.

Для установления возможности совместного применения грибного штамма Xk-1 Ch. olivaceum и бактериального штамма 14-3 P. chlororaphis определяли их совместимость методом встречных культур (рис. 2).

Рисунок 2 – Совместимость перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов на 10 сутки инкубации:

а – штамм 14-3 P. chlororaphis ;

б – штамм Xk-1 Ch. olivaceum.

На 7-е сутки инкубации наблюдалась явная антагонистическая активность штамма 14-3 P. chlororaphis по отношению к штамму Хk-1 Ch. olivaceum , которая выражалась в образовании антибиотической зоны (14 мм), тогда как в чистой культуре гриб занял всю площадь питательной среды чашки Петри. На 10-е сутки совместного культивирования расстояние между штаммами сократилось до 8 мм, однако вблизи зоны мицелий штамма Xk-1 был тонкий, паутинистый, плодовые тела отсутствовали. На 14-е сутки инкубации изменений не произошло. Таким образом, нами установлено, что штаммы Xk-1 и 14-3 несовместимы между собой, что исключает их совместное применение.

Следующим этапом исследований стало определение совместимости разработанных лабораторных образцов микробиопрепаратов и химических фунгицидов, разрешённых к применению на сое, с целью определения возможности их совместного применения в интегрированной системе защиты сои от комплекса болезней. Установлено, что штамм 14-3 P. chlororaphis совместим со всеми фунгицидами, рекомендуемыми в настоящее время для обработки семян сои: ТМТД, ВСК (тирам, 400 г/л), Максим, КС (флу-диоксонил, 25 г/л), Фундазол, СП, (бено-мил, 500 г/кг). Это делает возможным его применение в сложных композиционных составах для обработки семян сои. Грибной штамм Xk-1 Ch. olivaceum оказался совместим только с ТМТД, ВСК (тирам, 400 г/л), который оказывал на него незначительное ингибирующее действие. Такие препараты, как Максим, КС (флу-диоксонил, 25 г/л) и Фундазол, СП, (беномил, 500 г/кг) существенно задерживали рост гриба, что исключает их совместное применение [26].

Выводы. По итогам ступенчатого скрининга отобраны перспективные штаммы-продуценты микробиопрепаратов: Хк-1 Ch. olivaceum и 14-3 P. chloro-raphis, обеспечивающие эффективную защиту семян и проростков сои на жёстком фоне искусственного заражения фу-зариозом во влажной камере и в почве, активно колонизирующие корень, одновременно оказывающие стимулирующее влияние на культуру сои.

Для штамма 14-3 P. chlororaphis установлены оптимальные условия (температура 25,0–30,0 ^оС, рН 5–10) и сроки культивирования (с учетом синтеза максимальной концентрации антибиотических веществ) – 72 часа, элементы питания (источники углерода – глюкоза, глицерин, сахароза и меласса; источники азота – пептон и дрожжевой экстракт), питательные среды (пептон-дрожжевая и Кинга В).

При изучении совместимости лабораторных образцов микробиопрепаратов и химических фунгицидов была определена возможность их совместного применения в интегрированной системе защиты сои от комплекса болезней (14-3 P. chloro-raphis – с ТМТД, ВСК, Максим, КС, Фундазол, СП; Хк-1 Chaetomium olivaceum – с ТМТД, ВСК). Совместное же применение штаммов Xk-1 и 14-3 не представляется возможным.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-08-00726-а и программы У.М.Н.И.К., государственный контракт №14046.