Разработка микросателлитных маркеров для генотипирования эфиромасличной розы российской селекции

Введение. Основной целью селекции эфиромасличной розы Института сельского хозяйства Крыма является создание новых сортов с улучшенными признаками [1]. Важное значение для этого направления имеют исследования по анализу генетического разнообразия существующих сортов, используемые в подборе родительских растений для скрещивания, разработке генетических паспортов сортов, а также в защите прав селекционеров [2].

Изучение генетического разнообразия основано на исследовании полиморфизма ДНК с использованием ДНК-маркеров – специфических идентифицируемых последовательностей ДНК, характеризующихся определенной локализацией на хромосомах и служащих "метками" для изучения вариаций в последовательностях ДНК [3; 4].

Микросателлиты (simple sequence repeats, SSR) – это простые повторяющиеся последовательности ДНК с единицей повтора, называемой также мотивом, состоящей из 2–6 нуклеотидов. Эффективные SSR-маркеры являются монолокус-ными, мультиаллельными и кодоминантными, то есть позволяют обнаружить оба аллеля микросателлитного локуса, в отличие от аллель-специфичных маркеров.

Метод микросателлитного анализа используется для оценки генетического разнообразия, ДНК идентификации генотипов, филогенетического анализа, установления родственных связей и генетической паспортизации [3–5]. Для создания SSR-маркеров необходима информация о последовательностях ДНК, фланкирующих микросателлиты. При разработке поли- морфных маркеров используются повторы различной длины – ди-, три- и тетранук-леотидные [3].

В большинстве исследований по микро-сателлитному анализу розы применяется система SSR-маркеров, разработанная несколькими отдельными авторами [6–11].

Мы не обнаружили данных из литературы о применении SSR-маркеров для изучения эфиромасличной розы российской селекции. В связи с этим актуально разработать систему микросателлитных маркеров для генотипирования, оценки генетического разнообразия и генетической паспортизации эфиромасличной розы.

Цель исследований – разработать новые SSR-маркеры для оценки генетического разнообразия эфиромасличной розы и провести первичную оценку их функциональности с применением электрофореза в агарозном геле.

Материалы и методы. Исследования проводили в 2024 г. в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» в лаборатории молекулярной генетики, протеомики и биоинформатики в сельском хозяйстве. Микросателит-ные маркеры анализировали на четырех сортах коллекции эфиромасличной розы селекционно-семеноводческого центра эфиромасличных культур НИИСХ Крыма (с. Крымская роза, Белогорский район, Республика Крым) – Легрина, Лань, Мичу-ринка и Романца (таблица) [12].

Таблица

Образцы коллекции эфиромасличной розы НИИСХ Крыма

Table

Samples from the collection of essential-oil roses at Research Institute of Agriculture of Crimea

Образец	Биологический статус
Мичуринка	сорт ( R. damascena Mill. × R. gallica L.)
Романца	сорт [( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill. × R. gallica L.)]
Лань	сорт [Белая ( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill. × R. gallica L.)]
Легрина	сорт [Белая ( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill. × R. gallica L.)]

Разработку микросателлитных маркеров проводили на основе нуклеотидных последовательностей семи хромосом эталонного генома розы китайской ( Rosa chinensis ) из базы RefSeq (NCBI) по следующему алгоритму: поиск микросателлитных повторностей в хромосомах R. chinensis и извлечение нуклеотидных последовательностей с фланкирующими областями в GMATA; фильтрация микросателлитных последовательностей по количеству повторов в R; выравнивание полученных последовательностей на геном розы дамасской ( R. damascenа ) в NUCLEOTIDE BLAST; подбор пар праймеров на основе отобранных последовательностей и их оценка на соответствие критериям пригодности (отсутствие предсказанных неспецифичных продуктов амплификации с длиной менее 1000 п.н. и внутригенная локализация) в PrimerBLAST и проверка пар праймеров на вероятность образования димеров в Multiple Primer Analyzer.

Дополнительно подбирали SSR-маркеры из литературных источников [9– 11] и оценивали их на соответствие вышеописанным критериям с использованием Primer-BLAST.

ДНК выделяли с применением оптимизированного СТАВ-метода [13]. Содержание и чистоту выделенной ДНК определяли с применением электрофореза в 1,5 % агарозном геле и спектрофотометра FlexA-200 («Allsheng», Китай).

В ПЦР-смесь входили следующие компоненты (общий объем 20 мкл): 2,5 единицы SmarTaq ДНК-полимеразы («Диалат», Россия), 1-кратный буфер 10X AmpliDD для полимеразы, содержащий 2,5 ммоль MgCl 2 («Диалат», Россия), 0,2 ммоль дНТФ («Евроген», Россия), 10 пмоль праймера («Синтол», Россия), 40 нг ДНК. ПЦР выполняли в термоциклере GeneExplorer («BIOER», Китай) по программе: начальная денатурация – 3 мин при 94 °С; далее 35 циклов: денатурация – 30 с при 94 °С; отжиг – 30 с при 60 °С или 55 °С; элонгация – 1 мин при 72 °С; финальная элонгация – 10 мин при 72 °С.

Детекцию продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 2 % агарозном геле в 1-кратном ТАЕ-буфере при напряжении тока 100 В в течение 1 ч 30 мин. Окрашивание – бромистым этидием. Продукты ПЦР визуализировали с помощью системы гель-документирования GenoSens 2200 («Clinx», Китай). Размер фрагментов определяли с помощью программы GelAnalyzer 23.1 [14]. Затем сравнивали фактические размеры ампликонов с величинами, полученными при конструировании праймеров в Primer-BLAST.

Результаты и обсуждение. В общей сложности изучено 45 маркеров из упомянутых ранее источников [9–11]. По результатам оценки микросателлитных маркеров из публикаций в Primer-BLAST оказалось, что: 1) большинство маркеров из статей содержит динуклеотидный повтор в микросателлитной последовательности, что повышает риск образования stutter-продуктов [15; 16]; 2) микросателлиты с тринуклеотидным мотивом образуют несколько продуктов с близкими по значению размерами, то есть являются неспецифичными при их проверке в PrimerBLAST. В связи с этим мы сочли эти маркеры несоответствующими критериям использования для генотипирования.

Для разработки SSR-маркеров с целью генотипирования эфиромасличной розы мы использовали геном R. chinensis , как единственного представителя рода Rosa L., референсный геном которого представлен в базе данных RefSeq в полной сборке. Микросателлитные последовательности, извлеченные из генома R. chinensis , мы выравнивали на геном R. damascenа с целью отбора последовательностей, имеющих наиболее точную гомологию. R. damascenа является предковой формой многих эфиромасличных роз, однако ее геном представлен только в виде предварительной сборки, выполненной на уровне скаффолдов. На основе сопоставленных гомологичных последовательностей мы конструировали праймеры.

Разработано всего 100 SSR-маркеров: 1-я хромосома – 8 маркеров; 2-я хромосома –

24 маркера; 3-я хромосома – 18 маркеров; 4-я хромосома – 7 маркеров; 5-я хромосома – 19 маркеров; 6-я хромосома – 9 маркеров; 7-я хромосома – 15 маркеров.

В среднем для всех семи хромосом были получены микросателлитные последовательности следующей длины (в нуклеотидах): 21 – 55 последовательностей; 24 – 20 последовательностей; 27 – семь последовательностей; 28 – пять последовательностей; 30 – четыре последовательности; 32 – одна последовательность; 33 – одна последовательность; 36 – пять последовательностей; 40 – одна последовательность; 42 – одна последовательность.

Распределение маркеров по количеству нуклеотидов в мотиве было следующим: тринуклеотидных маркеров – 91 маркер, тетрануклеотидных – семь маркеров, пен-тануклеотидных – один маркер и гекса-нуклеотидных – один маркер.

Проверка подобранной температуры отжига и работоспособности каждого праймера проводилась на четырех генотипах эфиромасличной розы. В случае отсутствия визуализации продуктов SSR-ПЦР при температуре отжига праймеров 60 °С ее понижали до 55 °С.

Из 100 пар праймеров 21 пара оказалась непригодной по следующим причинам: 1) для шести пар выявлено отсутствие визуализации продуктов даже при понижении температуры отжига до 55 °С; 2) 15 пар праймеров образовали неспецифические фрагменты на электрофореграмме.

Таким образом, по результатам детекции и анализа продуктов ПЦР было отобрано 79 пар сконструированных SSR-праймеров, дающих воспроизводимые и точно интерпретируемые фрагменты ДНК у генотипов эфиромасличной розы (рисунок). 73 пары праймеров давали продукты амплификации при температуре отжига 60 °С, а шесть – при 55 °С.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о пригодности разработанных микросателлитных маркеров для последующего изучения генетического разнообразия эфиромасличной розы.

M 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Рисунок – Электрофореграмма продуктов SSR-ПЦР ДНК эфиромасличной розы с праймерами 97-7, 98-7, 99-7, 100-7:

М – маркер длины ДНК Step100 Long от 100 до 3000 п.н.; 17–20 – праймер 97-7; 21–24 – праймер 987; 25–28 – праймер 99-7; 29–32 – праймер 100-7

Figure – Electrophoregram of SSR-PCR products of essential-oil rose DNA with primers 97-7, 98-7, 99-7, 100-7:

M – Step100 Long DNA length marker from 100 to 3000 bp; 17–20 – primer 97-7; 21–24 – primer 98-7; 25– 28 – primer 99-7; 29–32 – primer 100-7

Заключение. При проверке микроса-теллитных маркеров из публикаций с помощью Primer-BLAST оказалось, что большинство из них содержит динуклео-тидные повторы, что повышает риск образования stutter-продуктов, а маркеры с тринуклеотидным мотивом дают несколько неспецифичных продуктов с близкими размерами. Разработаны новые SSR-маркеры на основе семи хромосом эталонного генома R. chinensis (RefSeq, NCBI). Всего создано 100 маркеров (по 7– 24 на хромосому), из которых 55 микроса-теллитных последовательностей имеют длину 21 нуклеотид, а 91 маркер содержит тринуклеотидные мотивы.