Разработка мультиплексной панели микросателлитов для генетической паспортизации сибирского осетра (Acipenser baerii)

Сибирский осетр ( Acipenser baerii Brandt, 1869) — один из наиболее значимых видов рыб, выращиваемых в условиях товарной аквакультуры. Основные преимущества сибирского осетра — быстрое накопление массы и высокая выживаемость в промышленных условиях разведения (1, 2). К важным факторам успешного разведения этого вида относится способность производить высококачественную икру. Благодаря экономической значимости и высокому спросу на продукцию сибирского осетра его разведение имеет значительный потенциал для развития аквакультуры (3).

В дикой природе сибирский осетр находится в статусе исчезающего вида вследствие загрязнения окружающей среды, бесконтрольного вылова, деградации естественной среды обитания. Вид занесен в Красную книгу Международного союза охраны природы и природных ресурсов МСОП (4). Кроме того, сибирский осетр включен в приложения 1 и 2 Конвенции о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися под угрозой исчезновения (Convention on International Trade in Endangered species of wild fauna and flora, CITES) (5). Неудовлетворительное состояние диких популяций обязывает сохранять биоразнообразие в стадах сибирского осетра на рыбоводных заводах и грамотно использовать генетический потенциал аквакультуральных популяций (6).

Современные методы племенной работы опираются на данные, получаемые с помощью молекулярной генетики. Это позволяет существенно ускорить и упростить работу по повышению продуктивности у сельскохозяйственных видов животных и растений (7-9). Однако в осетроводстве внедрение этих технологий в повседневную селекционную практику замедлилось. На сегодняшний день молекулярно-генетические маркеры (в первую очередь, микросателлиты и митохондриальная ДНК) применяются для контроля видовой принадлежности с целью дальнейшего использования молоди для восполнения природных популяций (10). Сложности разработки молекулярно-генетических панелей для индивидуальной идентификации сибирского осетра связаны с тем, что вид имеет тетраплоидный геном (11), при этом определенные локусы могут проявлять диплоидный или даже гек-саплоидный характер (12, 13).

Применению молекулярно-генетических методов непосредственно в селекции сибирского осетра также препятствует продолжительное время созревания этого вида и сложившаяся на рыбоводных заводах система разведения, предполагающая смешивание половых продуктов от нескольких рыб-производителей. Это существенно снижает отход, повышает процент оплодотворенной икры, но и препятствует точному соотнесению родителей и их потомков, что необходимо при проведении селекционной работы. Массовое внедрение на осетровых заводах индивидуального мечения рыб-производителей с использованием электронных чипов создает благоприятные предпосылки для применения молекулярно-генетических методов в племенной работе.

В настоящей работе впервые дана характеристика известным мик-росателлитным локусам у сибирского осетра с точки зрения возможности эффективного учета доз их аллелей в тетраплоидном геноме. Обнаружено семь локусов, соответствующих этому критерию.

Целью нашей работы стало создание панели микросателлитных маркеров, адаптированной для использования в селекции сибирского осетра ленской популяции.

Методика. Исследования проводили в 2023 году. В качестве биологического материала использовали срезы плавниковой ткани сибирского осетра ленской популяции, взятые от рыб экспериментального стада, со- держащегося в установке замкнутого водоснабжения Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Экспериментальное стадо было представлено двумя группами: I — рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Горетово, Можайский городской округ, Московская обл.; n = 42), II — рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.; n = 47).

ДНК выделяли помощью набора ДНК-Экстран-2 (НПК «Синтол», Россия) согласно протоколу фирмы-производителя. Качественную оценку ДНК осуществляли методом электрофореза в агарозном геле (1,2 % агарозы). ПЦР проводили в конечном объеме 15 мкл. В пробирки вносили по 14 мкл реакционной смеси, состоящей из 1,5 мкл 10½ Turbo-буфера (ЗАО «Евроген», Россия), 1,5 мкл 2 мМ раствора dNTPs, 0,3 мкл 10 мМ смеси праймеров, 1 ед. Smart Таq-полимеразы (ЗАО «Диалат Лтд.», Россия), добавляли ~ 50-100 нг исследуемой геномной ДНК, доводили до конечного объема деионизированной водой. Реакции выполняли на амплификаторе Thermal Cycler SimpliAmp («Thermo Fisher Scientific, Inc», США) в следующем режиме: 10 мин при 94 ° С (первичная денатурация); 30 с при 95 ° С (денатурация), 40 с при 58 ° С (отжиг праймеров на ДНК-матрице), 35 с при 72 ° С (элонгацию цепей) (38 циклов); 5 мин при 72 ° С (финальная элонгация). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в системе капиллярного электрофореза Нанофор 05 (НПК «Синтол», Россия). Размеры аллелей определяли с помощью программного обеспечения GeneMаrker (Version 3.0.1). Для каждого локуса определяли дозу каждого аллеля (14).

Апробацию собранных панелей проводили на I и II группах экспериментального стада сибирского осетра. Для каждой из групп рассчитывали классические популяционно-генетические показатели: ожидаемую (H e ) и наблюдаемую (H o ) гетерозиготность, среднее число аллелей на локус (Na), среднее число эффективных аллелей (Ne), коэффициент инбридинга (F IS ), генетические дистанции по методу M. Nei (15), индекс F st (16, 17). Для обработки данных микросателлитного анализа использовали R-пакет Polysat (Version 1.7) (18), STRUCTURE (Version 2.3.4) (19), SPA Ge Di1-5d (20). PCA (Principal Coordinate Analysis)-плот был построен на основе вычисления генетических дистанций по методу R. Bruvo с соавт. (21).

Результаты. Поскольку необходимо было создать мультиплексные микросателлитные панели с единообразным характером плоидности локусов, а также отсутствием нулевых аллелей, отбор микросателлитных маркеров имел достаточно жесткие условия. Локус не должен был иметь более четырех аллелей у одного образца, не должен иметь нулевых аллелей, должен обладать стабильной амплификацией в ПЦР при условии мультиплексирования и полиморфизмом, доза каждого аллеля должна визуально хорошо определяться.

Для создания панели микросателлитных маркеров, предназначенной для индивидуальной идентификации и контроля достоверности происхождения сибирского осетра, мы протестировали 27 микросателлитных локусов: Ls 19, Aox 45, Aox 9, Ls 68 (22, 23), Agu 38, Ag 49a, Agu 37, Agu 41, Agu 15, Agu 51, Agu 59, Agu 34, Agu 36, Agu 46, Agu 56, Agu 54 (24), AoxD 161, AfuG 63, AfuG 51, AfuG 112, An 20, Aru 13, Aru 18, Afu 68 b, Spl 163, AfuG41, Ls 39 (25, 26). В ряде локусов (AoxD 161, AfuG 41, Agu 59) было идентифицировано более 4 аллелей (рис. 1), и такие локусы исключили из дальнейшего анализа.

Как известно, наличие нулевых аллелей приводит к искажению статистических расчетов, завышая гомозиготность (27, 28). Виды с полиплоидными геномами имеют повышенный риск образования нулевых аллелей (29). Полиплоидизация может быть вызвана слиянием геномов, полиморфных по сайту отжига праймеров. Кроме того, считается, что сам процесс полиплоидизации сопровождается повышенной активности транспозонов и потерей участков ДНК из-за геномных перестроек (30), что также может разрушать сайты связывания праймеров (31). В связи с этим определение дозы аллелей было критическим требованием при отборе локусов. Определение дозы каждого аллеля (рис. 2) позволило выявить локусы, предположительно имеющие нулевые аллели (AfuG 51, Aru 13, Agu 15).

Рис. 1. Пример генетического профиля у особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции по локусу AoxD 161 с пятью выявленными аллелями (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год) .

Рис. 2. Определение дозы каждого аллеля микросателлитного локуса Ls 19 у особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции: А — особь с соотношением аллелей 1/2/1, Б — особь с соотношением аллелей 4/0, В — особь с соотношением аллелей 2/2. Стрелками указаны пики, соответствующие аллелям, цифрами обозначены дозы аллелей — число хромосом в тетраплоидном геноме, несущих данный аллель (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год).

Так, для микросателлитного локуса AfuG 51 было выявлено три аллеля с примерно одинаковым количеством полученного ПЦР-продукта (рис. 3). Поскольку геном сибирского осетра тетраплоидный, то четвертый аллель, скорее всего, должен быть нулевым, но мы наблюдали присутствие четвертого пика со слабым сигналом, который, вероятно, и был четвертым аллелем с измененным сайтом отжига праймера.

Рис. 3. Определение нуль-аллеля на примере локуса AfuG 51 у особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции: 235, 241, 255 — три аллеля с примерно одинаковой эффективностью синтеза в ПЦР, 259 — четвертый пик с низким значением флуоресценции, вероятно, соответствует аллелю с измененным сайтом отжига праймера (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год).

На небольшой выборке образцов ДНК сибирского осетра ( n = 16) было проведено предварительное тестирование возможности мультиплексирования микросателлитных локусов, а также явного отклонения от тетрапло-идного наследования. При этом подбор локусов для мультиплексной ПЦР также содержал требование сохранить возможность учета дозы аллелей при мультиплексировании ПЦР. В результате из 27 микросателлитных маркеров отобрали 7 позиций: Agu 38, An 20, Aru 18, Ls 19, Ag 49a, Agu 37, Agu 41 (табл. 1, рис. 4), которые были скомпонованы в две мультиплексные панели (панель 1: Agu 38, An 20, Aru 18; панель 2: Ls 19, Ag 49a, Agu 37, Agu 41).

• 1.    Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для тестирования особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baeri i Brandt, 1869) ленской популяции (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

  Локус	Метка	Диапазон аллелей по данным литературы, п.н. (22-26)	Диапазон аллелей по результатам исследования, п.н.	Последовательность праймеров
  			Панель 1
  Agu 38	6-FAM	108-114	90-112	F: ACTGGGGTTGAAGGACAGTG R: TCCGTCTCATGTCCAAGGGTA
  An 20	6-FAM	151-207	143-185	F: AATAACAATCATTACATGAGGCT R: TGGTCAGTTGTTTTTTTATTGAT
  Aru 18	R6G	138-154	137-145 Панель 2	F: CCTGGAACACGTCCAGTTTT R: TGGGTGAATGTTTTGGTGTG
  Ls 19	6-FAM	118-145	119-137	F: CATCTTAGCCGTCTGGGTAC R: CAGGTCCCTAATACAATGGC
  Agu 37	R6G	128-136	124-128	F: ACATGGTAGCAAAATCCCAA R: CAGCAAGCTTAGATGCATGG
  Agu 41	ROX	178-218	177-229	F: AAGACAAACAGTGGCCCAAC R: CAATGGCAGGTGCTACTGAA
  Ag49a	6-FAM	198-219	192-218	F: TGTTATCTGCTCTGATATTGATTCG R: CGTTTTAAAGTTTGAACGGCA

• 2.    Частота аллелей 7 микросателлитных локусов у особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции (расчет в программе SPAGeDi1-5d) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

  Локус   Группа	Na	Ne	H e	1    H o	Fis	PIC
  Все ( M ±SEM)   I + II	6,86±1,506	3,61±0,731	0,6535±0,07441	0,839±0,0976 - 0,191±0,0778
  I	4,43±0,519	2,90±0,476	0,5770±0,10235	0,816±0,1413 - 0,340±0,1106
  II	6,14±1,300	3,63±0,657	0,6744±0,05663	0,860±0,0653 - 0,173±0,0590
  Agu 38           I + II	6	3,45	0,7102	0,989	- 0,366	0,639
  I	5	3,13	0,6809	1,000	- 0,460	0,609
  II	5	3,32	0,6993	0,979	- 0,359	0,608
  An 20           I + II	13	6,17	0,8379	0,989	- 0,167	0,813

Результаты апробации собранных панелей в двух группах особей экспериментального стада сибирского осетра представлены в таблице 2.

Продолжение таблицы 2

	I	6	3,98	0,7486	1,000	- 0,335	0,688
	II	12	6,11	0,8365	0,979	- 0,156	0,803
Aru 18	I + II	4	1,45	0,3122	0,337	0,231	0,396
	I	3	1,05	0,0471	0,048	0,330	0,301
	II	4	1,98	0,4943	0,596	0,091	0,447
Ls 19	I + II	5	2,47	0,5953	0,854	- 0,158	0,526
	I	3	2,01	0,5028	0,857	- 0,397	0,429
	II	5	2,67	0,6258	0,851	- 0,172	0,526
Ag 49a	I + II	6	3,56	0,7193	0,966	- 0,291	0,653
	I	4	3,05	0,6723	0,976	- 0,411	0,591
	II	5	3,98	0,7491	0,957	- 0,233	0,687
Agu 37	I + II	4	2,33	0,5703	0,753	- 0,078	0,502
	I	4	2,56	0,6090	0,833	- 0,184	0,519
	II	3	2,01	0,5036	0,681	- 0,028	0,449
Agu 41	I + II	10	5,86	0,8295	0,989	- 0,180	0,793
	I	6	4,51	0,7781	1,000	- 0,282	0,724
	II	9	5,33	0,8123	0,979	- 0,185	0,767

Примечани е. I группа — рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Горетово, Можайский городской округ, Московская обл.; n = 42), II группа — рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.; n = 47). H o — наблюдаемая гетерозиготность, He — ожидаемая гетерозиготность, Na — среднее число аллелей на локус, Ne — среднее число эффективных аллелей на локус, F is — коэффициент инбридинга, PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса.

Рис. 4. Пример мультиплексирования локусов с сохранением эффекта дозы аллелей для особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции: А — панель ¹ 1 (локусы Agu 38, An 20; канал FAM), Б — панель ¹ 2 (локусы Ls 19, Ag 49a; канал FAM). Стрелками указаны пики, соответствующие аллелям, цифрами обозначены дозы аллелей (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год).

В сумме из 7 микросателлитных локусов наиболее эффективными оказались An 20 и Agu 41, что можно заметить по значениям индекса полиморфного информационного содержания локуса (PIC). Несмотря на то, что исследуемая выборка состояла из объектов аквакультуры, происходящих от дикого сибирского осетра ленской популяции, мы увидели четкую генетическую дифференциацию между исследуемыми группами экспериментального стада. Значение индекса фиксации Fst оказалось равным 0,0796, то есть 7,96 % изменчивости было обусловлено внутрипопуляционными различиями, а 92,04 % — межпопуляционными. Значение генетической дистанции, рассчитанное по M. Nei на основании частот аллелей 7 микросателлитных локусов, составило 0,1340. Генетическая дифференциация групп сибирского осетра хорошо выявлялась при формировании генетических кластеров в программе STRUCTURE (рис. 5), а также по результатам PCA-анализа (рис. 6).

Рис. 5. Результаты кластерного анализа особей одомашненной формы сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции, выполненного на основании частот аллелей 7 микроса-теллитных локусов в программе STRUCTURE для числа кластеров К = 2: I группа — рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Го-ретово, Можайский городской округ, Московская обл.), II группа — рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год).

•0.2      -0,1         0         0.1        0,2        0,3

Координата 1

Рис. 6. Локализация особей сибирского осетра в пространстве двух измерений на основании генотипирования по 7 микросателлитным маркерам. I группа (черный цвет) — рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Горетово, Можайский городской округ, Московская обл.), II группа (серый цвет) — рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.). PCA (Principal Coordinate Analysis)-плот построен на основе вычисления генетических дистанций по методу R. Bruvo с соавт. (21) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год).

Рассматривая полученные значения популяционно-генетических показателей, можно утверждать, что анализируемые группы сибирского осетра ленской популяции не являются инбредными. Учитывая относительно более низкие значения Na, Ne, H o и H e , можно сделать вывод о меньшем генетическом разнообразии I группы, полученной на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе. Этот эффект мог быть следствием ориентации завода на выпуск молоди осетровых для восполнения природных популяций и более жестких требований к происхождению производителей.

Поскольку для каждого микросателлитного локуса мы учитывали эффект дозы аллеля, то сравнили разрешающую способность микросател-литного анализа при игнорировании данных по этому эффекту и при его учете. При учете эффекта дозы аллеля в среднем по каждому локусу получили увеличение числа генотипов на 31,75 % (табл. 3).

3. Число генотипов сибирского осетра ( Acipenser baerii Brandt, 1869) ленской популяции с учетом и без учета эффекта дозы аллеля (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

Способ учета уникальных генотипов	Локус
	Agu 38	1 An 20 1	Aru 18 1	Ls 19 1 Ag 49a	Agu 37 \ Agu 41 1	∑
Без дозы аллеля	11	34	5	11         21	5         39	126
С учетом дозы	19	48	6	14        27	6        46	166

К сожалению, следует признать, что современное программное обеспечение для вычисления популяционно-генетических показателей плохо адаптировано для работы с данными по дозе аллеля микросателлитного локуса. Так, для конвертации файла данных с результатами генотипирования под форматы программ STRUCTURE и SPAGeDi мы использовали R-пакет Polysat, специально разработанный для анализа полиплоидных генотипов. При этом данные по дозе аллеля удалялись. Снижение качества анализа, однако, не приводило к критичным ошибкам при расчете популяционной статистики. В то же время при соотнесении генетических профилей родителей и потомков это может оказать существенное воздействие и привести к необходимости включения в анализ большего числа микросателлитных маркеров. Такая ситуация будет особенно заметна для стад, где среди производителей есть большая доля сибсов и полусибсов.

Микросателлитный полиморфизм дикой ленской популяции сибирского осетра исследован достаточно подробно (10, 14). Многие авторы изучали особенности генетической структуры аквакультуральных стад этого вида, однако среди подобных работ можно выделить исследование А.Е. Бар-минцевой с соавт. (32), в котором проведена сравнительная характеристика полиморфизма стад сибирского осетра ленской популяции из девяти хозяйств по пяти микросателлитным локусам. Как и в нашем исследовании, авторы выделили два четких генетических кластера, но характер их формирования имел существенные различия. Авторы отмечают необычный эффект — на принадлежность конкретной особи к кластеру определяющее значение оказывал год ее рождения. Независимо от принадлежности к хозяйству, особи генераций 1990-1996 годов образовывали единый кластер с дикими представителями ленской популяции, аквакультурный кластер формировался из особей, начиная с 2001 года рождения. В нашем исследовании этот эффект не повторился, мы получили четкую генетическую дифференциацию особей 2022 года рождения исключительно в зависимости от их происхождения. Сибирский осетр ленской популяции доместицирован в недавнем прошлом (1993 год) (33). В работе А.Е. Барминцевой с соавт. (32) тестирование проведено на выборках, представители которых относились к генерациям 1990-2008 годов. Если брать в расчет довольно значительный по отношению ко времени доместикации временной промежуток (2008-2022 годы), то вполне вероятным объяснением может оказаться постепенное накопление различий частот аллелей в современных маточных стадах сибирского осетра ленской популяции в разных хозяйствах в связи с проводимой селекционной работой. Также на выявление генетической дифференциации могло оказать влияние увеличение числа применяемых микро-сателлитных маркеров. Однако эти предположения нуждаются в проверке на других выборках.

Таким образом, использование разработанной нами мультилокусной панели из их семи микросателлитных локусов даже без учета данных по дозе каждого аллеля позволяет получать для каждой особи сибирского осетра уникальный, свойственный только для нее генотип. Это делает возможным создание индивидуальных генетических паспортов. Четкая дифференциация генетической структуры экспериментальных групп сибирского осетра, происходящих из двух разных предприятий, отражает влияние проводимой в хозяйствах селекционно-племенной работы. Наличие таких генетически дифференцированных стад может в дальнейшем быть полезно при формировании новых пород и линий. Перед выпуском молоди сибирского осетра в естественные популяции целесообразно проводить сравнение генетических профилей диких и выпускаемых рыб с целью контроля и сохранения особенностей генетической структуры нативных популяций. Разработка программного обеспечения, специально предназначенного для работы с данными, включающими дозу аллелей полиплоидных локусов, представляется весьма актуальной задачей. Создание такого инструмента позволит существенно улучшить разрешающую способность генетического анализа при работе с видами, обладающими полиплоидными геномами.

Выражаем благодарность ООО РТФ «Диана», Союзу осетроводов и лично А.В. Михайлову за предоставление рыбопосадочного материала сибирского осетра. За помощь в выполнении эксперимента благодарим главного рыбовода А.П. Глебова.