Разработка ПЦР тест-системы для индикации нетуберкулезных микобактерий в биологических образцах и окружающей среде

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в большинстве регионов России сохраняется благополучной. Однако наблюдаемое в последние годы увеличение количества реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин в благополучных хозяйствах обуславливают необходимость в высокоспецифичных тестах для их дифференциации [4, 9].

Одной из значимой причиной неспецифических реакций на наиболее широко применяемую внутрикожную туберкулиновую пробу являются нетуберкулезные микобактерии (НТМ) [5]. В наших предыдущих исследованиях была изучена распространенность и видовая структура нетуберкулезных микобактерий (НТМ). В 43 % исследованных образцов патологического материала, полученного от крупного рогатого скота с положительной реакцией на туберкулин, были обнаружены различные виды микобактерий: Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium и Mycobacterium scrofulaceum [2, 3]. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, которые также выявили высокую распространённость НТМ в различных регионах мира, что подтверждает глобальную значимость проблемы [1, 6, 7, 8].

Выявленное широкое распространение атипичных микобактерий подчеркивает необходимость точной дифференциации специфических и неспецифических реакций на туберкулин. В системе контроля заболеваемости туберкулезом это особенно важно для обеспечения высокой точности диагностики, чтобы положительные результаты однозначно указывали на наличие инфекции. Поддержание высокой достоверности диагностики критично, однако это не должно снижать общую эффективность системы эпизоотологического контроля, который должен оставаться надежным в выявлении всех случаев заболевания.

В связи с этим, целью исследований явилась разработка тест-системы ПЦР-РВ для индикации и идентификации нетуберкулезных микобактерий.

Материал и методы исследований. Для разработки праймеров и зондов были использованы полногеномные последовательности штаммов M. avium, M. paratuberculosis, M. fortuitum, M. intracellulare, M. smegmatis, M. scrofulaceum и M. kansasii из базы данных GenBank. Поиск консервативных участков и выравнивание последовательностей выполнены с использованием программы VectorNTI 9.1, а специфичность проверена с помощью BLAST-анализа (Basic Local Alignment Search Tool) на сайте National Center for Biotechnology Information .

Синтез праймеров, зондов и контрольной ДНК осуществлен ЗАО «Евроген», Россия.

Для оценки специфичности тест-системы ПЦР использовали ДНК референтных штаммов нетуберкулезных микобактерий: Mycobacterium smegmatis (in. 9-77 ), Mycobacterium scrofulaceum (in. 526 ), Мycobacterium kansasii (шт. ВИЭВ ), Mycobacterium paratuberculosis (шт. Центрально-Любинский ), Мycobacterium avium (шт. Vet. 1387 ), Мycobacterium intracellulare (шт. TMC 1473 ), Мycobacterium fortuitum (шт. 409 ).

Для определения аналитической чувствительности тест-системы методом лимитирующих разведений, а также создания положительных контрольных образцов (ПКО) для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали серию 10-кратных разведений выделенной суммарной ДНК референтных штаммов нетуберкулезных микобактерий и контрольной ДНК, содержащей все маркерные нуклеотидные последовательности.

В качестве контрольных отрицательных образцов (КО) использовали: 1) отрицательный контрольный образец этапа выделения (ОКО) – вместо исследуемой пробы вносили в пробирку 100 мкл дистиллированной воды; 2) отрицательный контрольный образец этапа ПЦР (К-) – вместо ДНК- пробы вносили в пробирку 5 мкл дистиллированной воды.

Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени Gentier 96E

(Tianlong, Китай). Реакционная смесь содержала по 10 пмоль каждого праймера, по 10 пмоль каждого зонда, 5 мкл буфера «5×qPCRmix-HS SYBR», 10 мкл ДНК, деионизированной воды до достижения суммарного объёма 25 мкл. Мультиплексные комбинации олигонуклеотидов были сформированы попарно в следующем порядке: М. kansasii + М. fortuitum ; М. scrofulaceum + М. paratuberculosis ; М. smegmatis + М. avium .

Результаты анализа продуктов ПЦР в реальном времени интерпретировались на основе пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что указывало на наличие или отсутствие значения порогового цикла (Ct). Образец считали положительным, если значение Ct было 35 или менее, и отрицательным на наличие маркерной ДНК, если значение Ct отсутствовало или превышало 37.

Результат исследований.

Разработана тест-система «НТМБ ПЦР-РВ» для индикации нуклеиновых кислот нетуберкулёзных микобактерий ( Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare ) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в биологических образцах и в объектах окружающей среды.

Структура и характеристики праймеров и зонда для обнаружения ДНК нетуберкулезных микобактерий представлены в таблице 1.

При подборе оптимальных условий проведения ПЦР-РТ определялись следующие параметры реакции: состав реакционной смеси (концентрация праймеров, зондов, нуклеиновых кислот); программа амплификации (температура отжига праймеров, продолжительность каждого шага цикла амплификации, количество циклов, длительность предварительной денатурации), обеспечивающие стабильное нарастание уровня флуоресценции по каналу детекции (Orange, Green, Red или Yellow), без искажения сигнала по другим каналам. ПЦР в режиме реального времени проводилась после первоначальной денатурации при 95 °С в течение 3 мин, в следующих условиях: 95 °С – 15 с, 58,5 °С – 30 с, 66 °С – 3 с – 5 повторов; 95 °С –15 с, 59 °С – 30 с – детекция, 66°С – 3 с – 40 повторов.

Таблица 1 – Структура и основные характеристики праймеров и зондов

Наименование	Структура 5` -› 3`	Размер п.о.	Размер ампликона, п.о.	Расчетная температура отжига, ºC
1	2	3	4	5
M. fortuitum, F	gaccaggaccaggaagatgaggc	23	128	59,8
M. fortuitum, R	tggcctggctggtgaccct	19		59,9
M. fortuitum, P	(R6G) gtcagggactcgacgccgtgaga (BHQ2)	22		64,3
M. intracellulare, F	gcccatcccacaccgcaa	18	88	59,7
M. intracellulare, R	ggataagcctgggaaactgggtcta	25		59,6
M. intracellulare, P	(ROX) tccacctaaagacatgcgcctaaagg tcctat (BHQ2)	32		66,6
M. kansasii, F	tcgcgtcggtggaggcag	18	70	60,3
M. kansasii, R	cgcacagggccgctgattt	19		60,5
M. kansasii, P	(ROX) cgtagacccgtccgccgttgagg (BHQ2)	23		67,0
M. paratubercul, F	ttacggaggtggttgtggcaca	22	146	59,7
M. paratubercul, R	aatcaactccagcagcgcgg	20		59,8
M. paratubercul, P	(ROX) cgcagcgattgctctcgcagc (BHQ2)	21		64,9
M. avium, F	cccatcccacaccgcaaaag	20	108	59,6
M. avium, R	agcaatctgccctgcacttcg	21		59,0
M. avium P	(R6G) acatgcgtcttgaggtcctatccggtat taga (BHQ2)	32		65,9
M. smegmatis, F	tcgggcgcacaacgttcc	18	137	60,0
M. smegmatis, R	gcagggtcgcggtgcgt	17		60,2
M. smegmatis, P	(ROX) cgacgccctgctcgacgagtgg (BHQ2)	22		67,6
M. scrofulaceum, F	gcttttgcggtgtgggatgg	20	79	59,8
M. scrofulaceum, R	gctacccgtcgtcgccttga	20		59,7
M. scrofulaceum, P	(R6G) tcaccccaccaactagctgataggccg (BHQ2)	27		67,2

Определение специфичности с использованием панели образцов референтных штаммов нетуберкулезных микобактерий методом ПЦР-РВ, показало наличие специфической амплификации в образцах, содержащих гомологичные штаммы, и отсутствие амплификации гетерологичных штаммов. Таким образом, специфичность тест-системы составляет 100 %.

Предел детекции оценивали троекратным тестированием разведений суммарной ДНК референтных штаммов нетуберкулезных микобактерий и положительных контрольных образцов. Исследование показало, что тест-система выявляет и идентифицирует ДНК Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium kansasii – в разведении 10⁻⁴, а Mycobacterium intracellulare , Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis     и     Mycobacterium scrofulaceum – в разведении 10⁻³. Что в сопоставлении      с      результатами амплификации контрольной плазмиды соответствовало двум копиям ДНК в 10 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Нуклеотидная последовательность контрольной плазмиды была следующей: «gacttggcaggcacagtatttgacagcggcggagcatgtgg atcgcgtcggtggaggcagtcgggcgcacaacgttccgtaga cccgtccgccgttgaggcgacgccctgctcgacgagtggagt gcaactggtttctgttggtagtaattgaaaatcagcggccctgtg cacgcaccgcgaccctgcgttcccttgtggcctgtgtgttacgg aggtggttgtggcacagactcctacgggaggcagcagtagcg cagcgattgctctcgcagcttttgcggtgtgggatggccgcgct gctggagttgattgtgagtgatgaaggctttcgggtcgaccagg accaggaagatgaggctcaccccaccaactagctgataggcc gtcagggactcgacgccgtgagacccatcccacaccgcaaaa gtcaaggcgacgacgggtagcccatcccacaccgcaagggt caccagccaggccacatgcgtcttgaggtcctatccggtattag atccacctaaagacatgcgcctaaaggtcctatcgaagtgcag ggcagattgctagacccagtttcccaggcttatcc»       в векторе pUC57. Концентрация плазмидной ДНК составила 50 нг/мкл.

Изучение        диагностической ценности тест-системы проводилось на образцах патологического материала, полученного от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин, а также на смывах с объектов внешней среды. При тестировании 100 проб патологического материала ДНК Mycobacterium kansasii была обнаружена в 19  % случаев,

Mycobacterium        avium        subsp.

paratuberculosis – в 7 %, Mycobacterium fortuitum – в 26  %, Mycobacterium intracellulare и Mycobacterium avium – в 13 %, а Mycobacterium scrofulaceum – в 21 % исследованных проб. В образцах смывов с объектов    внешней    среды ДНК

Mycobacterium       kansasii       была идентифицирована в 13,8  % случаев,

Mycobacterium        avium        subsp.

paratuberculosis – в 4,1 %, Mycobacterium fortuitum и Mycobacterium intracellulare – в 11,1 %, Mycobacterium avium – в 7 %, а Mycobacterium scrofulaceum – в 25 % исследованных проб. Достоверность полученных результатов, полученных с помощью разработанной ПЦР, была подтверждена классическими методами детекции микобактерий.

Результаты испытаний ПЦР тест-системы подтвердили её высокую эффективность и надежность, послужили основой для разработки нормативнотехнической документации и позволили получить декларацию о соответствии (POCC RU Д-RU.PA01.A.27461/24).

Заключение. Таким образом, разработана тест-система «НТМБ ПЦР-РВ» для выявления нуклеиновых кислот нетуберкулёзных    микобактерий    с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Установлена высокая аналитическая специфичность и чувствительность разработанной тест-системы по выявлению специфических    фрагментов    ДНК:

специфичность составила 100   %, специфическая чувствительность – 20 копий суммарной ДНК референтных штаммов нетуберкулезных микобактерий в

100 мкл исследуемого материала (100 мкл объём пробы для выделения ДНК). Показана возможность использования разработанной тест-системы для обнаружения ДНК атипичных микобактерий как в пробах патологического материала, так и в смывах с объектов окружающей среды. Применяемые контроли амплификации позволяют идентифицировать генетические маркеты бактерий принадлежащий к роду Mycobacterium и контролировать успешность ПЦР при исследовании патологического материала, и смывов с объектов окружающей среды.

Разработка нормативнотехнической документации и получение декларации о соответствии подтверждают готовность тест-системы «НТМБ ПЦР-РВ»

к применению в диагностике.