Разработка ПЦР в режиме реального времени для выявления полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита в пробах от крупного рогатого скота

Заразный узелковый дерматит (нодулярный дерматит, НД, бугорчатка, nodular dermatitis, lumpy skin disease, LSD) представляет серьезную угрозу скотоводству, в связи с чем необходимы надежные экспресс-методы для лабораторной диагностики заболевания на фоне применения живых гомологичных вакцин. Ранее предложенные и рекомендованные World Organization for Animal Health (Международное эпизоотическое бюро, Париж, OIE - МЭБ) методы выявляют также ДНК вирусов оспы овец и оспы коз. В классической ПЦР существует риск контаминации продуктами амплификации в связи с необходимостью электрофоретической детекции. C.E. Lamien с соавт. (2011) разработали метод детекции вируса заразного узелкового дерматита, вируса оспы коз и вируса оспы овец амплификацией фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Однако высокая зависимость метода от качества и концентрации ДНК в исследуемой пробе не позволяет использовать его в рутинной диагностике. Нами представлены результаты разработки, применения и оптимизации метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления ДНК полевых изолятов вируса LSD в образцах биоматериала от крупного рогатого скота. Специфичность метода оценили с использованием ДНК гомологичных и гетерологичных вирусов, депонированных в коллекции микроорганизмов ФГБУ ВНИИЗЖ. Разработанный метод продемонстрировал высокую специфичность в отношении полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита. Ложноположительных результатов с аттенуированным вакцинным штаммом и родственными каприпоксвирусами не выявлены. Чувствительность метода, которую оценивали, используя 10-кратные разведения ДНК референтного штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 (диагностический), составила 0,21 lg ТЦД50/мл. Показана эффективность амплификации 98,6 % с вариабельностью стандартного отклонения (±SD) при тестировании пяти 10-кратных разведений в 3-кратной повторности от 0,11 до 0,33. Валидацию метода проводили с образцами от экспериментально зараженных животных. Быков заражали подкожно, отбирали пробы цельной крови и носовых смывов. Дополнительно образцы анализировали методом классической ПЦР по D.C. Ireland и Y.S. Binepal (1998) (данные не приведены). При тестировании предложенная нами тест-система ПЦР-РВ для выявления ДНК полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита показала высокую специфичность и чувствительность и может быть рекомендован для анализа полевых образцов в профильных ветеринарных лабораториях.