Разработка полиспецифического эритроцитарного антительного ботулинического диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации

В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота зимеет широкое распространение и представляет потенциальную опасность для генофонда племенного молочного скота.

Перед нами была поставлена цель: изучить морфофункциональные изменения в органах репродуктивной системы у РИД(+) коров.

Задачи исследований:

проанализировать     материалы     акушерско-гинекологической диспансеризации коров в обследуемых хозяйствах за 2011 - 2013 г.;

провести мониторинг состояния репродуктивной системы РИД(+) и РИД(-) коров в динамике;

проанализировать данные ректального и ультразвукового исследований;

изучить макро- и микроморфологические изменения в половой системе у РИД(+) коров;

Материал и методика исследований. Исследования проводились на базе кафедры физиологии и зоогигиены Ижевской ГСХА. Объектом исследования послужили коровы черно-пестрой породы с голштинизацией от 60 до 90%. Было отобрано по 60 голов из трех хозяйств разных районов Удмуртской Республики стационарно неблагополучных по лейкозу и благополучных по другим инфекционным заболеваниям. Собирали анамнез, использовали ретроспективный анализ документов ветеринарного учета и отчетности, проводили клинический осмотр животных, ректальное, ультразвуковое исследование органов репродуктивной системы, патоморфологическое и гистологическое исследование. Были отобраны по 60 коров каждом хозяйстве: 30 голов - РИД (+) и 30 голов РИД(-).Эти животные имели длительный сервис-период (не менее 70 дней) и диагноз симптоматическое бесплодие.

Клиническое исследование животных включало в себя:

• -    определение габитуса;

• -    измерение температуры тела, пульса, частоты дыхания;

• -    наружный осмотр (при этом особое внимание обращали на состояние лимфатических узлов);

• -    ректальное исследование на 10, 30 и 45 день после отела;

• -    ультразвуковое исследование матки и яичников на 10, 30 и 45 день после отела.

В течение опыта часть животных (25 гол) отправлена на убой. Было проведено патоморфологическое исследование внутренних органов, особое внимание уделяли состоянию органов репродуктивной системы и лимфатических узлов. Отобрали пробы яичников и участков матки для гистологического исследования.

Результаты исследований. Продолжительность сервис-периодов коров в среднем по хозяйствам составляет от 72 до 142 дней, и с возрастом животных она увеличивается.

Установлено, что в третьем хозяйстве наблюдался наименьшее количество послеродовых осложнений. Задержание последа у коров в первом хозяйстве составляет 40%, во втором послеродовый эндометрит -33% и задержание последа 30 - 36%, в третьем хозяйстве - послеродовый эндометрит - 20-26%.

Таким образом, при ректальном исследовании РИД (+) коров изменения в матке и яичниках отмечены у 90% животных, РИД (-) - 30%, поражение яичников чаще одностороннее.

Сервис-период коров в среднем по отдельным хозяйствам составляет у РИД(-) коров 97, 108, 76 дней, РИД(+) - 102, 129, 72 дня. В большинстве случаев с возрастом его продолжительность увеличивается.

Родовспоможение оказывают в 60, 83 и 20% случаев у РИД(-) коров и в 70, 90 и 24% случаев РИД(+) коров. При этом в 23, 13 и 46% случаев у РИД (-) и лишь в 6, 10 и 50% случаев у РИД (+) коров отсутствуют послеродовые осложнения. Послеродовые осложнения встречаются у животных как отелившихся самостоятельно, так и при оказании помощи при родах.

Чаще выявляются задержание последа, послеродовый эндометрит и субинволюция матки. Во всех хозяйствах частота встречаемости послеродового эндометрита выше других патологических процессов и составляет 30, 33 и 20% у РИД(-) коров и 30, 33 и 26% у РИД(+) коров по хозяйствам.

На 10-й день после отела у 33, 13 и 53% РИД(-) и 14, 10 и 54% РИД(+) животных по данным ректального исследования инволюция матки завершена.

К 30-му дню после отела инволюция матки завершена у 50, 50 и 77% РИД(-) и 59, 50 и 87% РИД(+) коров. Наибольший процент изменений связан с проявлением катарального эндометрита в 30, 33, и 13% РИД(-) и 31, 41 и 12% РИД(+). Катарально-гнойный не регистрируется. В 20% случаев можно обнаружить желтые тела в яичниках. У 23% из группы РИД(-) и у 33% коров из группы РИД(+) на поверхности яичников обнаруживаются созревающие фолликулы.

К 45-му дню после отела процент коров с завершившейся инволюцией матки в среднем по хозяйствам: 20, 10 и 7% РИД(-) и 6, 9 и 8% РИД(+) животных. Катаральный эндометрит отмечается чаще у РИД(+) коров от 5 до 8%. У животных хозяйства №2 такая патология уже не встречается.

При макроскопическом исследовании материала подтвердили нарушения, определенные во время ректального исследования. При гистологическом исследовании яичников РИД(+) коров специфических изменений не отмечалось.

Гистологические изменения в эндометрии коррелируют с изменениями в яичниках. При наличии в яичнике желтых тел с кистами, в эндометрии отмечается уменьшение толщины функционального слоя и количества желез в нем.

Выводы. Состояние репродуктивной системы коров у РИД(+) коров в неблагополучных по лейкозу хозяйств оказалось со значительными патологическими процессами (эндометритом, субинволюцией матки).

СОСТОЯНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ КОРОВ В НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ ПО ЛЕЙКОЗУ ХОЗЯЙСТВАХ

Метлякова А.А.

Резюме

Лейкоз крупного рогатого скота представляет потенциальную опасность для генофонда племенного молочного скота. При ректальном исследовании РИД (+) коров изменения в матке и яичниках отмечены чаще, чем у РИД (-). При гистологическом исследовании яичников РИД (+) коров специфических изменений не отмечалось. Гистологические изменения в эндометрии коррелируют с изменениями в яичниках.

COWS REPRODUCTIVE SYSTEM STATUS IN LEUKEMIA UNFAVOURABLE FARMS

Metlyakova AA. Summary

Leukemia cattle poses a potential threat to the gene pool of breeding dairy cattle. At rectal examination RID (+) cows changes in the uterus and ovaries more marked than that of RID (-). Histological examination of the ovaries RID (+) cows specific changes were noted. The histological changes in the endometrium correlate with changes in the ovaries.

УДК 619:615.371

РАЗРАБОТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИТЕЛЬНОГО БОТУЛИНИЧЕСКОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Мустафин Т.Р. - м.н.с.; Иванов А.А. - д.б.н.; Мустафина Э. Н. - к.в.н., с.н.с.; Садыков Н.С. - зав. лаб., д.в.н., профессор

Возбудители ботулизма — Clostridium botulinum — классифицируются как один вид, однако это неоднородная группа бактерий. C. botulinum представляют собой анаэробные подвижные грамотрицательные (в молодых культурах) палочки; образуют при неблагоприятных условиях овальные субтерминальные споры; продуцируют нейротоксины (ботулотоксины). Однако токсины, проявляя сходную фармакологическую активность, имеют различные антигенные свойства, т. е. антитела к одному токсину не нейтрализуют другие. Известно 8 серологических вариантов ботулотоксина и, соответственно, 8 серологических типов C. botulinum — А, В, С1, С2 (не имеет свойств нейротоксина), D, Е, F и G, которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками. Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками, что обеспечивает необычную устойчивость токсин во внешней среде и длительное сохранение активности. Токсин ботулизма прочно связан с белком микроба и попадает в организм животного только при аутолизе клетки. Токсин выделяется в среду хозяина по мере синтезирования, не задерживаясь в клетке при активном росте микроба [3].

Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым обнаруживая свою адаптированность к ряду различных органов и тканей. Однако это есть единая форма болезни, в которой разные локализации возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, почки, легкие, нервная система). К ботулизму чувствительны люди, многие виды животных и птицы. Из лабораторных животных чувствительны белые мыши и морские свинки.

Основой лабораторной диагностики ботулинического токсина или возбудителя ботулизма является биопроба на белых мышах. В качестве экспресс методов лабораторной диагностики используют определение фагоцитарного показателя и постановку РНГА с сенсибилизированными антитоксическими сыворотками. Однако, при вскрытии животных, павших от «колбасного яда», точно поставить диагноз не всегда удается, ведь концентрация токсина в крови ничтожна. Поэтому вопрос по быстрой и точной диагностике ботулизма, в некоторых случаях, стоит весьма остро. Например, в условиях чрезвычайной ситуации, военного положения, при угрозе применения биологического оружия, а также в случаях отравления продуктами питания людей.

На сегодняшний день нет средств и методов индикации возбудителя ботулизма, обнаружения ботулинического токсина ускоренным методом.

Цель работы настоящих исследований является, разработка современных тест-систем для выявления патогенного анаэроба Clostridium botulinum и индикации его токсина в продуктах животноводства, а также в объектах внешней среды. Все вышесказанное и обуславливает безусловную актуальность настоящей работы и необходимость создания экспресс анализа.

Материалы и методы. Проведена работа по получению поливалентной гипериммунной ботулинической сыворотки на кроликах, по следующей схеме. Для получения гипериммунной сыворотки использовали антигены (из 4^х культур) приготовленные тремя методами: 1) живая культуральная жидкость с содержанием возбудителя и нейротоксического комплекса; 2) гамма – облученный; 3) инактивированный формалином. Из культур готовили образцы, которые состояли из смеси четырех (А, В, С, D) типов в соотношении 1:1:1:1, для гипериммунизации. В опыт брали 3 группы кроликов – иммунизацию проводили тремя видами антигенов, различными дозами и интервалом между введениями. Интервал между введениями 4 дня, за день до следующего введения у кроликов брали кровь, для определения титра ботулиновых антител в РНГА, РА.

Предварительно, после последнего введения взвеси, пробы крови исследовали на 3й день, а тотальное обескровливание (из сердца) провели на 7 день после последнего введения антигена. Полученная нами поливалентная сыворотка, состоящая из смеси (А,В,С,Д) типов, наработанная по схеме №1 (гипериммунизация кроликов внутривенно, внутривенно, внутривенно) с конечным титром АТ в сыворотке крови 1:64 в РНГА [5].

Исходя из литературных данных видно, что титры антител после иммунизации как моно- так и поливалентными антигенами одинаковы. Следовательно, при иммунизации поливалентными антигенами явление «конкуренции антигенов» отсутствовало [2].

Результаты исследований. Из поливалентной сыворотки получали глобулины, путем осаждения сульфатом аммония, на его основе создали антительный эритроцитарный диагностикум для обнаружения возбудителя Cl.botulinum и его токсина в объектах внешней среды. Антительный эритроцитарный диагностикум приготовлен на основе формалинизированных эритроцитов барана с глобулином, полученных к возбудителю ботулизма по общепринятой методике в нашей модификации.

Проведенные исследования в РНГА с использованием полиспецифического эритроцитарного антительного диагностикума, в сравнении с моновалентными ботулиническими сыворотками показало, что моносыворотки положительно реагировали в титрах 1:16 – 1:32, в то время как разработанный нами диагностикум давал положительный результат со всеми типами (А, В, C, D, Е, F, G) в титрах от 1:8 до 1:32, при отрицательных результатах в контроле.

Заключение. На сегодняшний день нет ускоренных методов индикации возбудителя ботулизма в объектах внешней среды и в патологическом материале. Исследования продуктов питания животного происхождения на безопасность проводятся многоступенчатыми способами – посевы на питательные среды (среда Китт-Тароцци, многослойный агар и т.п.), выделение клостридий методом каталитической оксидации водорода в воде, выращивание в индифферентном газе и т.д. Окончательный результат получают биологической пробой на мышах.

По данным видно, что наиболее перспективным при получении поливалентных сывороток является использование культуральной жидкости с содержанием живого возбудителя и нейротоксического комплекса, по сравнению с инактивированными формами возбудителя. При этом титр антител в сыворотке крови был на два разведения выше.

Разработана    методика    получения    полиспецифического эритроцитарного антительного диагностикума для экспресс индикации возбудителя ботулизма и ботулинового токсина в объектах внешней среды и патологическом материале.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. - Омск: Изд. ОмГАУ, 1996. – С. 314 – 319. 2. Матвеев К.И. Ботулизм. – М.: Медицина, 1959. – С. 5-41, 350-361. 3. Никифоров В.Н., Никифоров В.В. Кн.: Ботулизм. - Л.: Медицина, 1985. – С 104-116. 4. Иванова М. А. Ботулизм : учеб.-метод. пособие / М. А. Иванова. – Минск : БГМУ, 2009. – 24 с. ISBN 978-985-462-801-1. 5. Иванов А. В., Мустафин Т.Р., Мустафина Э. Н. Ветеринарный врач № 3, 2013 С.810.

РАЗРАБОТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИТЕЛЬНОГО БОТУЛИНИЧЕСКОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Мустафин Т.Р., Иванов А.А., Мустафина Э.Н., Садыков Н.С.

Резюме

Разработана методика гипериммунизации кроликов с использованием антигенов из 4х типов, для получения полисывороток и дальнейшего использования его в получении полиспецифического эритроцитарного антительного ботулинического диагностикума. Для индикации возбудителя ботулизма и ботулинового токсина в реакции непрямой гемагглютинации, в объектах внешней среды и патологическом материале.

DEVELOPMENT OF POLYSPECIFIC ERYTHROCYTЕ BOTULINIC ANTIBODY DIANOSTIC KIT FOR INDIRECT HEMAGLUTINATION TEST

Mustafin T.R., Ivanov А. А., Mustafina E.N., Sadykov N.S.