Разработка полиспецифического эритроцитарного ботулинического антигенного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации

В конце XIX века профессор медицины Ван Эрменгем изучал причины пищевых отравлений. Используя методы микробиологических исследований, он выделил из кишечника людей, скончавшихся после дегустации различных сортов колбас и ветчины, подозрительные бактерии, которые не встречались в кишечной флоре здоровых людей. Он назвал их Bacillus botulinus, что в переводе с латыни означает Бацилла «колбасная», так вошло в современную медицину страшное заболевание - ботулизм [2].

Ботулизм – остро протекающая кормовая токсикоинфекция, вызываемая токсином анаэробного спорообразующего микроба Bacillus botulinus. Эпидемиология ботулизма исключительно специфична и не укладывается в классические представления об эпидемиологии инфекционных болезней. Источником заболевания может служить только больной человек или больное животное. Тяжелая интоксикация возникает в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины Clostridium botulinum, характеризующаяся преимущественно поражением центральной и вегетативной нервной системы.

С другой стороны широкое распространение возбудителя ботулизма в природе послужило причиной мнения, что возбудитель убиквитарен и может размножаться и образовывать токсин в почве. В настоящее время известно 7 типов возбудителя ботулизма (А, В, C, D, Е, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками. В почве, кормах, пищевых продуктах и питательных средах они образуют субтерминально расположенные споры в виде теннисной ракетки. По морфологии возбудители ботулизма – небольшие палочки длиной 4 – 9 мкм и шириной 0,6 – 0,9 мкм с закругленными концами.

Вегетативные клетки обладают выраженной подвижностью. Жгутики в количестве от 3 до 35 расположены по всему телу, капсулы не образуют. Вегетативные формы возбудителя ботулизма погибают при 80оС за 30 минут. Споры выдерживают кипячение от 1,5 до 6 часов, при температуре 115оС они погибают через 30 – 40 минут, при 120оС – через 320 минут.

Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками. Такое строение обеспечивает необычную устойчивость токсина во внешней среде и длительное сохранение активности.

Основу лабораторной диагностики ботулинического токсина или возбудителя является исследование остатков пищевых продуктов, каловых масс, из трупов берут кусочки печени, тонкого кишечника и желудка с содержимым; биопроба на белых мышах. В качестве экспресс методов лабораторной диагностики определяют фагоцитарный показатель и ставят РНГА с сенсибилизированными антитоксическими сыворотками. Ботулизм, как и столбняк, относится к группе сапрозоонозов, т.е. к числу болезней, общих для человека и животных, причем как человек, так и животные заражаются из окружающей среды, особенно из почвы.

Возбудитель ботулизма широко распространен в окружающей среде, 159

он обнаруживается в почве, воде, на свежих фруктах, овощах, фураже, силосе, иле, продуктах домашнего консервирования, кишечнике человека и животных и т.д. Поэтому вопрос по быстрой и точной диагностике ботулизма, в некоторых случаях, стоит весьма остро. Например, в условиях чрезвычайной ситуации, военного положения, при угрозе применения биологического оружия, а также в случаях отравления продуктами питания людей.

На сегодняшний день нет средств и методов экспресс индикации возбудителя ботулизма, обнаружения ботулинического экзотоксина ускоренным методом. Все вышесказанное и обуславливает безусловную актуальность настоящей работы и необходимость создания экспресс анализа на обнаружение возбудителя ботулизма и его токсинов в пищевых продуктах.

Цель работы настоящих исследований является, разработка современных тест-систем для выявления патогенного анаэроба Clostridium botulinum и индикации его токсина в продуктах животноводства, а также в объектах внешней среды.

Материалы и методы: Проведена работа по получению токсинов из штаммов возбудителя ботулизма, для этого были взяты 4 штамма: тип А – № 98; тип В – 16-Я; тип С - № 91; тип Д – SHU, которые засевали в колбы объемом (1,0 л) со средой Хоттингера с 1% глюкозы, рН 5,0 под вазелиновым маслом и помещали в термостат при температуре 35⁰С и культивировали в течение 8 суток. После удаления вазелинового масла содержимое колбы центрифугировали при 4000 об/мин. в течение 45 мин., надосадочную жидкость отсасывали, все это ставили на магнитную мешалку при температуре +4⁰С на 20 мин., в нее добавляли высушенную соль сульфата аммония (оптимальная концентрация для осаждения токсина 50 % к общему объему). По истечении этого времени, центрифугировали при 6000 об/мин, в течение 20 мин, надосадок удаляли, а осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде (рН 4,0) 1:10 от общего объема (на 1 л – 100 мл дистиллированной воды). Токсичность полученного препарата определяли в реакции нейтрализации (РН) на белых мышах по общепринятой методике.

Для получения корпускулярных антигенов, вышеперечисленную культуру возбудителя ботулизма (4 типа) высевали на МПА с 2% глюкозы и культивировали в анаэростате, при температуре 340С в течение 3х суток, после чего выросшую культуру смывали 0,85% изотоническим раствором NaCl. Инактивацию культур проводили двумя методами: 1) биологическим (радиационным); 2) химическим (формалинизация).

Радиационный метод - заключается в воздействии гамма-лучей на бактериальную клетку с целью инактивации. При этом определена доза поглощения для возбудителя ботулизма, которая составила 30 кГр., путем проверки на стерильность.

Химический метод - заключается в инактивации бактериальной взвеси путем внесения в нее 40-го % формалина, и определения конечной концентрации его бактерицидного действия на бактериальную взвесь Cl. botulinum. После внесения формалина в бактериальные взвеси, их культивировали в термостате при температуре 340С в течение 3х недель, проверяя на стерильность.

Результаты исследований. В дальнейшем использовали бактериальные взвеси полученные по вышеперечисленным методикам, для получения антигенного эритроцитарного диагностикума. Для получения использовали антигены (из 4^х культур) приготовленные тремя методами: 1) живая взвесь; 2) гамма – облученный; 3) инактивированный формалином. Из живой и инактивированных культур, готовили 200 млн. взвесь, в соотношении 1:1:1:1.

Антигенный эритроцитарный диагностикум приготовлен на основе формалинизированных эритроцитов сенсибилизированных глобулином, полученных токсинами возбудителя ботулизма (АГ). Получение эритроцитарного антигенного диагностикума проводилась по общепринятой методике в нашей модификации.

Проведенные исследования в РНГА с использованием полиспецифической сыворотки, в сравнении с моносыворотками показало, что ботулинические моносыворотки положительно реагировали в титрах 1:8 – 1:32, в то время как поливалентная сыворотка давала положительный результат со всеми типами (А, В, C, D, Е, F, G) в титрах от 1:16 до 1:128, при отрицательных результатах в контроле.

Заключение. На сегодняшний день нет ускоренных методов индикации возбудителя ботулизма в объектах внешней среды и в патологическом материале. В настоящее время исследования продуктов питания животного происхождения на безопасность проводятся многоступенчатыми способами (посевы на питательные среды, выделение выращивание в индифферентном газе и т.д.), окончательный результат получают биологической пробой на мышах. Разработка полиспецифического эритроцитарного антигенного ботулинического диагностикума дает возможность для ускоренного выявления в сыворотках крови наличия токсина возбудителя ботулизма всех типов в РНГА.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. - Омск: Изд. ОмГАУ, 1996. – С. 314 – 319. 2. Матвеев К.И. Ботулизм. – М.: Медицина, 1959. – С. 5-41, 350-361. 3. Никифоров В.Н., Никифоров В.В. Кн.: Ботулизм. - Л.: Медицина, 1985. – С 104-116.

РАЗРАБОТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО БОТУЛИНИЧЕСКОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Мустафин Т.Р., Иванов А. В., Мустафина Э.Н., Садыков Н.С.

Резюме

Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РНГА позволяет обнаружить минимальные количества антител. Разработана методика наработки антигена, для получения полиспецифического эритроцитарного антигенного диагностикума, для индикации возбудителя ботулизма и ботулинового токсина в реакции непрямой гемагглютинации.

DEVELOPMENT OF POLYSPECIFIC ERYTHROCYTЕ BOTULINIC ANTIGEN DIANOSTIC KIT FOR INDIRECT HEMAGLUTINATION TEST

Mustafin T.R., Ivanov А.V., Mustafina E.N., Sadykov N.S.