Разработка радиомодифицированных мутантов микроорганизмов для профилактики и лечения радиационных поражений животных

Микроорганизмы, относящиеся к нормофлоре человека и животных, играют важную роль в жизнедеятельности организма-носителя, а именно в полезном воздействии продуктов метаболизма, защите против чужеродных агентов, нормализации его микробаланса [7]. Использование микробных агентов может благоприятно повлиять на исход заболевания при патологическом состоянии организма [2], снизить смертность животных при облучении, способствовать формированию радиорезистентности [3]. В процессе жизнедеятельности бактерии продуцируют ферменты, антигены, энтеро-, экзотоксины, цитокины, которые в отдельности и в сочетании друг с другом обладают радиозащитными свойствами [7]. Облучение микроорганизмов может вызвать изменение выработки метаболитов, таких как антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. [1, 4, 5, 6, 7].

Цель исследований – получение ра-диомодифицированных мутантов E.coli и B.bifidum для профилактики и лечения радиационных поражений животных.

Материал и методы исследований. В качестве исходного материала использовали лиофилизированную монокультуру «Бифидумбактерин» и лабораторный штамм Escherichia coli «ПЛ-6». Микроорганизмы культивировали при 37±1оС в питательных средах МПБ, МПА (E.coli) и Блаурокка (B.bifidum). Моделирование радиационного воздействия осу- ществляли на гамма-установке «Исследователь» с источниками излучения 60Со и мощностью воздействия 0,022 А/кг.

Диапазон доз для E.coli составлял 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 кГр; для B.bifidum -0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32; 0,6; 1,2; 2,4; 4,8 кГр.

После радиационного воздействия микроорганизмы высевали в питательные среды и через 96 часов учитывали рост колониеобразующих единиц (КОЕ). При наличии единичных колоний наращивание биомассы проводили повторным пересевом микробов до появления сплошного роста культуры, что свидетельствовало о развитии радиорезистентности культур.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов проводили общепринятыми методами.

Взвеси микробов радиорезистент-ных вариантов E.coli (R 10) и B.bifidum (R 6 ) в культуральной жидкости в концентрации 1,0^х10^-10 м.к./мл и культуральные жидкости без бактерий были использованы для приготовления формол-препаратов, которые были инактивированы добавлением 0,3-0,5 %-ного нейтрального формалина и стабилизированы термостатированием при 37 ^оС в течение 30 минут.

Полученные препараты исследовали на стерильность посредством посева на питательные среды; безвредность – внутрибрюшинным введением 0,5 см3/гол 30 белым мышам; раздражающее и сенсиби- лизирующее действие формол-препаратов оценивали на 6 белых кроликах, которым препараты наносили на слизистую ротовой полости и глаз, проводили внутрикожную инъекцию и внутривенное двукратное введение с интервалом 22 суток.

Моделирование лучевой болезни тяжелой степени (ЛД 100/30 ) осуществляли однократным облучением животных на гамма-установке «Пума» в дозе 7,7 Гр с мощностью 0,82 А/кг. Радиозащитную активность препаратов оценивали на 100 белых мышах массой 18-20 г, разделенных на 10 групп. Животным 1-4 групп препараты вводили за 1 сутки до облучения однократно подкожно в дозе 0,1 см³/гол, 5-8 групп – аналогично через 1 сутки после радиационного воздействия. Мыши 9-й и 10-й групп служили контролем облучения и биологическим контролем.

Результаты исследований . После облучения кишечной палочки в дозах 0,5 и 1,0 кГр наблюдали сплошной рост колоний (табл. 1); 2,0 кГр – на чашках Петри регистрировали разряженные пространства; при 4,0 кГр наблюдали единичные колонии, которые переходили в сплошной рост после пятикратного пассирования. Доза 6,0 кГр являлась стерилизующей.

Облучение B.bifidum 1 в дозах 0,010,32 кГр не повлияло на рост культуры; при дозе 0,6 кГр на столбиках 0,75 %-ного агара Блаурокка регистрировали разряженные пространства, которые выглядели менее плотным после воздействия в дозе 1,2 кГр; при дозе 2,4 кГр вырастали единичные колонии, которые после 7 пассирования образовывали сплошной рост; доза 4,8 кГр являлась стерилизующей (Табл.1).

Таблица 1 – Радиомодифицирующее действие γ-лучей на бактерии (кГр)

Вид бактерий	Показатели роста колоний
	СР	РК	ЕК	РО
E.coli («ПЛ-6»)	0,5-1,0	2,0	4,0	6,0
B.bifidum (1)	0,01-0,32	0,6-1,2	2,4	4,8

Примечание: СР – сплошной рост колоний; РК – разреженные колонии; ЕК – единичные колонии; РО – рост отсутствует

Сравнение радиоустойчивых бактерий E.coli (R10) и B.bifidum (R6) с необлу-ченными аналогами показало следующее: E.coli (R10) на твердых средах образовывали колонии с шероховатыми краями различной величины, на препаратах микробы отличались увеличением размеров, неровностью структуры, полиморфностью и плотностью; B.bifidum (R6) были полиморфны, неоднородны, дискообразны, имели толщину 0,5-0,8 и диаметр – 1,0-1,5 мм. В суспензионной и культуральной жидкостях E.coli (R10) содержалось в 1,80 и 2,51 раза больше дезоксирибонуклеиновой кислоты; пероксидазная активность была выше в 2,18 и 1,67 раза; исходные бактерии не продуцируют ферменты супе-роксиддисмутазу и каталазу, но эти свойства приобрели бактерии E.coli (R10), в суспензионной и культуральной жидкостях которых содержалось супероксид-дисмутазы и каталазы соответственно 1,95±0,15 и 0,97±0,09 м.к.М/г и 21,51±0,75 и 27,38±0,59 м.кат/г/мл (Табл. 2).

Таблица 2 – Содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты, ферментов супероксиддисмута-зы, каталазы и пероксидазы у бактерий E.coli «ПЛ-6» и (R 10 )

Вид бактерий	ДНК, мкг/1,0Е9 м.к.	СОД, м.к.М/г	КАТ (Е-2), м.кат/г/мл	АП (Е-4), с-1 мг-1
E.coli «ПЛ-6»	8,5/3,3	0,0/0,0	0,0/0,0	1,1/0,3
E.coli (R10)	15,3/8,7	1,95/0,97	0,22/0,27	2,4/0,5

Примечание: ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; СОД – супероксиддисмутаза; КАТ – каталаза; АП – пероксидаза

В культуральной жидкости радио-резистентных бактерий содержалось больше аминокислот: в 2,0 раза глицина, 1,8 раза – серина и в 2,3 раза – цистеина (Табл. 3). У радиоустойчивых бифидобактерий, по сравнению с нативными, было зарегистрировано увеличение содержания антиокислительного фермента перосидазы: в клеточной суспензии в 2,05 раза, в экстракте – в 2,14 раза, в культуральной жидкости – в 1,45 раза. Активность антиокис-лительного фермента пероксидазы в клеточной суспензии была максимальной – 0,000343 с-1мг-1 (Табл. 4).

Таблица 3 – Содержание аминокислот в культуральной жидкости бактерий E.coli «ПЛ-6» и (R 10 ) (с^-1мг^-1)

Вид бактерий	Глицин	Серин	Цистеин
E.coli «ПЛ-6»	1,07±0,21	0,009±0,001	1,10±0,13
E.coli (R10)	2,13±0,13	0,016±0,001	2,57±0,34

Таблица 4 – Пероксидазная активность бактерий B.bifidum 1 и (R 6 ) (с^-1мг^-1)

Вид бактерий	Содержание пероксидазы в субстратах (1,0х10-4)
	КС	КЭ	КЖ
B.bifidum 1	1,69±0,1	0,35±0,04	0,31±0,03
B.bifidum 1 (R6)	3,47±0,2	0,75±0,08	0,45±0,05

Примечание: КС – клеточная суспензия; КЭ – клеточный экстракт; культуральная жидкость

Активность фермента глютати-онпероксидазы у радиоустойчивого штамма кишечной палочки была в 3,55 раза и у бифидобактерий в 5,34 раза выше. На основе полученных радиомодифицирован-ных вариантов E.coli и B.bifidum были изготовлены 4 варианта радиопротектирую-щих препаратов, которые были исследованы на стерильность, безвредность и адгезивность.

Образцы препаратов, помещенные в бактерийные среды, в течение 10 суток оставались стерильными – роста микробной и грибковой флоры не было зарегистрировано.

Внутрибрюшное введение формол-препаратов белым мышам не повлияло на аппетит и поведенческие реакции у животных; содержание эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей оставалось в пределах физиологической нормы.

Нанесение препаратов кроликам на слизистые оболочки ротовой полости и глаз, внутрикожное и внутривенное применение показало отсутствие раздражающего и сенсибилизирующего действий.

Изучение противорадиационных свойств препаратов при профилактическом (за 1 сутки до) и лечебном (через 1 сутки после облучения) применении показало, что таковые при любом их использовании повышали, как среднюю продолжительность жизни, так и процент выживших животных. Выживание 80 % животных достигалось при использовании препаратов, изготовленных из радиомодифицирован-ных бактерий E.coli (R10). Количество выживших животных при применении B.bifidum (R6) составляло 60 %. Все мыши группы контроля облучения пали. Средняя продолжительность жизни животных:

• -    при профилактическом применении бактериальной массы E.coli (R 10 ) составляла 17,5 суток;

• -    при профилактическом применении бактериальной массы B.bifidum (R 6 ) – 16 суток;

• -    при профилактическом применении культуральной жидкости E.coli (R 10 ) – 15 суток;

• -    при лечебном применении бактериальной массы E.coli (R 10 ) – 14,5 суток;

• -    при лечебном применении культуральной жидкости E.coli (R 10 ) – 12,5 суток;

• -    при лечебном применении бактериальной массы B.bifidum (R 6 ) в культуральной жидкости – 14,5 суток;

• -    при профилактическом применении культуральной жидкости B.bifidum (R 6 ) – 12,5 суток;

• -    при лечебном применении культу-

• ральной жидкости B.bifidum (R6) – 12,5 суток;

• -    средняя продолжительность жизни только облученных животных составляла 6,9 суток.

Заключение. Получены стабильные радиорезистентные бактерии E.coli (R 10 ), выживающие при дозе 4 кГр (превышение исходного уровня в 2,14 раза) и бактерии B.bifidum (R 6 ), выживающие при дозе 2,4 кГр (превышение исходного уровня в 2,5 раза).

Штаммы образовывали колонии с шероховатыми краями различной величины, отдельные микробы на препаратах отличались увеличением размеров, неровностью структуры, полиморфностью и плотностью.

У радиомодифицированных штаммов кишечной палочки, по сравнению в нативной культурой в суспензионной и культуральной жидкостях содержалось в 2,18 и 1,67 раза больше пероксидазы и в 1,80 и 2,51 раза – дезоксирибонуклеиновой кислоты; в культуральной жидкости: в 2 раза – глицина; 1,8 – серина и 2,3 раза – цистеина.

Биохимические исследования культуральных жидкостей исходных препаратов показали, что содержание фермента глютатионпероксидазы у бактерий E.coli (R 10) и B.Bifidum (R 6 ) было в 3,55 и 5,34 раза выше, чем у исходных микроорганизмов. Формол-препараты, изготовленные из бактерийных масс и продуктов их метаболизма, обладали противорадиационными свойствами, защищая 60-80 % летально облученных животных, увеличивая среднюю продолжительность жизни павших до 11,5-17,5 дней.

Резюме

Воздействием последовательно увеличивающихся доз γ-излучения получены стабильные радиорезистентные бактерии, выживающие при дозах 4,0 (E.coli «R 10 ») и 2,4 кГр (B.bifidum «R 6 »). В отличие от исходных микроорганизмов радиорезистентные бактерии имели большее содержание ДНК, ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпе-роксидазы, аминокислот глицина, серина, цистеина. Изготовленные из радиорезистентных штаммов препараты, отвечали серологическим требованиям, обладали противорадиационными свойствами, защищали 60-80 % летально облученных животных, до 11,5-17,5 суток увеличивали среднюю продолжительность жизни павших против 6,9 суток в группе контроля облучения.

DEVELOPMENT RADIOMODIFICATING OF MUTANTS OF MICROORGANISMS FOR